27 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义溶源转变lysogenic conversion 接合：供体菌（F＋菌株，雄性菌株）通过性菌毛与受体菌（F-菌株，雌性菌株）直接接触，把F 质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新的遗传性状。F+菌株；F-菌株；Hfr 菌株；F’菌株。特点：两细胞直接接触；需要性因子性因子可通过接合获得。原生质体融合：通过人工的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，从而获得兼有两亲本遗传性状的重组子。原生质体技术的优越性：去掉了细胞壁的障碍，亲株基因组可直接融合、交换，并为链霉菌实现基因转化创造了条件；二亲株的基因组之间可发生多次交换，得到多种类型的重组子， 且参与融合的亲株不限于一个，可以多至3、4 个；重组频率高；可用诱变的方法直接处理原生质体，提高突变率；再生成细胞壁的过程常伴随治理的消除，使染色体发生改变；极其简单，操作方便，不需要贵重药品。

28 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义如何得到原生质体：菌体（菌丝）培养；细胞壁的去除；原生质体的融合（再生）； 检出重组子。再生频率的计算： 原生质体数H－原生质体数水再生频率＝———————————— 原生质体总数（血球计数） 原生质体技术的应用：利用原生质体形成及再生达到改良亲本的目的（大环内酯类抗生素）；利用原生质体诱变提高突变率（庆大霉素）；利用原生质体融合获得性的抗生素（Indolizomycin）；利用再生，得到了产量提高的变异菌株，例如生二素链霉菌（Streptomytece ambofaciens）通过原生质体再生，螺旋霉素的生产能力提高了三倍多。质粒消除的结果常常导致细胞染色体的改变，或使次级代谢途径发生变化(白霉素和金丝霉素)，出现有利于提高抗生素产量的变异菌株。有效的种间融合，使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发一些原来为“沉默基因’的表达，从而产生新物质。同时种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。真核微生物的基因重组有性杂交（sexual hybridization） 准性杂交（parasexual hybridization） 同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，常见于半知菌类。准性杂交过程：菌丝联结（anastomosis）；形成异核体（heterocaryon）；核融合（nuclear fusion）；体细胞交换（somatic crossing-over）和单倍化。第四节基因工程基因工程(gene engineering) 遗传工程（genetic eng ineering）：人工的离体的分子水平上的遗传重组技术。基本操作：获取目的基因；优良载体的选择； 目的基因与载体DNA 的体外重组；重组载体导入受体细胞（转化）；重组受体细胞的筛选和鉴定；工程菌的表达。

29 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义对质粒载体的要求：是一个独立的复制子；具有较多的单一限制性内切酶位点；有方便的筛选标记；具有外源DNA 片段插入失活的附加标记；高拷贝数。应用： 生产多肽类药物:干扰素(interferon)，白细胞介素（ interleukin ）； 生产疫苗：乙肝疫苗； 改造传统工业发酵的菌种； 改良动植物的特性； 用于环境保护的“超级菌”的构建。工程菌的不稳定性。

30 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义第五节菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退和复壮衰退（degeneration）:菌种的特性发生了负变，如生长速度减慢、代谢产物合成能力下降。菌种衰退的原因：自发突变。衰退的防止：控制传代次数；创造良好的培养条件；利用不易衰退的细胞传代； 采用有效的菌种保藏方法。复壮：从已衰退的群体中筛选出少数没有退化的个体。菌种的复壮：纯种分离法(pure culture isolation)，包括菌落纯（pure culture in colony lever）和菌株纯（ pure culture in strain lever ）； 通过寄主体复壮。菌种的保藏菌种保藏的意义：菌种是一个国家极其重要和宝贵的生物资源。菌种保藏的原理：通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温， 使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。菌种保藏的方法： 斜面冰箱保藏法：斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后， 置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月沙土管保藏法：适合于产孢子或芽孢的微生物。将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1 年左右。菌丝速冻法：对于不产孢子或芽孢的微生物，一般不能用沙土管保藏。为了方便可以采用甘油菌丝速冻法。由于该法的保藏温度为-20℃，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。石蜡油封存法：向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。真空冷冻干燥保藏法：目前常用的较理想的一种方法。在真空中使水分升华。微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。菌种保存时间一般５年左右。需要一定的设备。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。液氮超低温保藏法：适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。原理：用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(－130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。需要保护剂，常用的保护剂为10%甘油。先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降低到-35℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。国内菌种保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of

31 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义Microorganisms． CCCMS)委托中国科学院负责担负全国菌种保藏管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。l)普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌。中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS—IV)：病毒。2)农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）。3)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFI)。4)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国医学科学院皮肤病研究所，南京(ID):真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5)抗生素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗生素研究所，北京(IA)。四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗生素菌种。6)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所，北京。国外菌种保藏机构l)ATCC American Type Culture Collection． Rockvill． Maryland． U.S.A． 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。2) CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U.S.A． 冷泉港研究室，美国。3) IAM Institute of Applied Microbiology. University of Tokyo， Japan． 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。4) IFO Institute for Fermentation. Osaka, Japan． 发酵研究所,日本大阪。5) KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo， Japan． 科研化学有限公司，日本东京。6) NCTC National Collection of Type Culture. London , United Kingdom． 国立标准菌种收藏所，英国伦敦。7) NIH National Institutes of Health. Bethesda， Maryland， U.S.A． 国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。第一节微生物在自然界中的分布与菌种资源的开发第九章微生物的生态生态学（ecology）:研究生命系统和和环境系统间相互作用规律的科学一些概念：生物圈(biosphere)；生态系统(ecosystem)；群落(community)；种群(population)；个体(individual)；器官(organ)；组织(tissue)；细胞(cell)； 细胞器(organelle)；分子(molecule)。微生物生态：各种环境因素对微生物的作用及微生物对外界环境的反作用。微生物在自然界的分布：海陆空。

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