沉淀
等电点沉淀：PH值，中和电荷
盐析：高浓度的盐溶液使蛋白质沉淀，离子中和电荷，如(NH4)2SO4
盐溶：低浓度的盐溶液使蛋白质溶解，蛋清的溶解。
有机溶剂沉淀：降低溶液的介电常数。
<5>蛋白质变性：蛋白质在某些外界因素的影响下，理化性质改变、生物活性丧失的现象。这些因素包括热、酸、碱、有机剂等。
蛋白质变性理论：吴宪，1931年提出。蛋白质的功能直接由蛋白质的构象来决定，某些外界因素改变了蛋白质的独特构象，因而使生物活性丧失。但不改变蛋白质的一级结构（即共价结构）。蛋白质的变性与水解是不同的。
当环境条件恢复时，蛋白质的生物活性有可能也恢复，这就是蛋白质的复性。
这一理论在实践中有很重要的指导意义，能够解释酶为什么有最适的PH和最适的温度。
<6>蛋白质的颜色反应：可以用来定量定性测定蛋白质
双缩脲反应：红色，?m＝540nm
黄色反应：与HNO3的反应，生成硝基苯，呈黄色。皮肤遇到HNO3的情况，白→黄→橙黄。
米伦氏反应：与HgNO3 或HgNO2的反应，呈黄色，原理同上。
与乙醛酸的反应：红色，Trp的吲哚基的特定反应。
坂口反应：红色，Arg的胍基的反应。
福林反应：蓝色，是Tyr的酚基与磷钼酸和磷钨酸的反应。
印三酮反应：紫红色
Pauly反应：樱红色，His的咪唑基。
二.蛋白质的一级结构及其测定
1.蛋白质的结构层次：1、2、超2、结构域、3、4
2.一级结构：即蛋白质的共价结构或平面结构，核心内容就是aa的排列顺序，它的改变涉及到蛋白质共价键的破坏和重建。
一级结构的全部内容包括：肽链的个数、aa的顺序、二硫键的位置、非aa成分。
3.蛋白质一级结构的测定
间接法：通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断aa的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。
直接法：用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出aa顺序。
<1>第一步：前期准备
分离纯化蛋白质：纯度要达到97％以上才能分析准确。
蛋白质分子量的测定：渗透压法、凝胶电泳法（聚丙烯酰胺、SDS）、凝胶过滤法、超离心法等
aa组成的测定：氨基酸自动分析仪
肽链拆分：非共价键的如氢键、离子键、疏水键、范德华力4种，可用尿素或盐酸胍等有机溶液来拆分。共价键的仅二硫键1种，可用巯基乙醇、碘代乙酸、过甲酸来拆分。
<2>第二步：肽链的端点测定
N端测定：Sanger法，DNFB→DNP-肽→水解→乙醚萃取→层析鉴定
Edman法，PITC→PTC-肽→PTH-aa→层析鉴定
C端测定：肼解法，P83，唯有C端aa与众不同，酰肼化合物与游离aa，再通过Sanger法来鉴定。Asn、Gln、Cys、Arg将被肼破坏，不能分析。
羧肽酶法：配合动力学控制。
羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基
羧肽酶B：仅Arg、Lys
羧肽酶C：所有的氨基酸残基
<3>每条肽链aa顺序的测定：aa顺序自动分析仪只能准确测定50aa以下的肽链，而一般的蛋白质都含有100以上的aa残基，所以，事先要将蛋白质打断成多肽甚至寡肽，再上机分析，而且要2套以上，便于以后拼接。
常用的工具酶和特异性试剂有：
胰蛋白酶：仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。
糜蛋白酶：仅作用于含苯环的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。 Trp、Tyr、Phe
CNBr：仅作用于Met的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。
拼接：将2套多肽的aa顺序对照拼接，举例：
156987351256984523→15 698735 125 69845 23
→1569 873512569 84523
<4>第四步：二硫键位置的确定：包括链内和链间二硫键的位置，用对角线电泳来测。在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解之，可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳，将产物分开。再用过甲酸、碘代乙酸、巯基乙醇处理，将二硫键打断。最后进行第二向电泳，条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品（多肽或寡肽），它们就是含二硫键的片段，上机测aa顺序，根据已测出的蛋白质的aa顺序，把这些片段进行定位，就能找到二硫键的位置。如下图
4.蛋白质一级结构测定的意义
<1>分子进化：将不同生物的同源蛋白质的一级结构进行比较，以人的为最高级，从而确定其它物种的进化程度，也可以制成进化树，由于这是由数据决定的，因此比形态上确定的进化更加科学和精确。
<2>证明了一个理论，即蛋白质的一级结构决定高级结构，最终决定蛋白质的功能。
<3>疾病的分子生物学：镰刀型贫血症的内因是血红蛋白的?6Val，正常的血红蛋白的?6Glu
三.蛋白质的二级结构
1.二级结构概论
<1>二级结构的定义：肽链主干在空间的走向。主干指的是肽平面与?-C构成的链子，见P95。
<2>二级结构的内容：空间走向以及维持这种走向的力量：氢键和R基团的影响（离子键、疏水键、空间障碍等）
<3>二级结构的数学描述：?角：肽平面绕N-C?单键旋转的角度
?角：肽平面绕C?-C羧基单键旋转的角度，见P95。
至于+-方向的规定，0度角的规定太复杂，不作要求。
这样，一个肽平面的空间位置可以被2个二面角来确定，如果每个肽链的两个二面角（?,?）都相同，则构成了规则的空间走向，所以可以用（?,?）来描述肽链的二级结构。
2.二级结构的常见类型
Pauling的贡献，X光衍射法是研究蛋白质构象的最好技术，羊毛蛋白和蚕丝蛋白，单调一致，诺贝尔化学奖。
<1>?-右手螺旋
?-螺旋即像弹簧一样的螺旋，有右手与左手之分，自然选择蛋白质的?-螺旋为右手螺旋。示范。
?-右手螺旋的数据：每一圈含有3.6个aa残基（或肽平面），见P96的b，每一圈高5.4&Aring;，即每一个aa残基上升1.5&Aring;，旋转了100度，2个二面角（?,?）＝（-570，-480）。
维持?-右手螺旋的力量是链内氢键，它产生于一个肽平面的C=O与相邻一圈的在空间上邻近的另一个肽平面的N-H之间，见P96b，它的方向平行于螺旋轴，因此，?-右手螺旋的外观是个筒状的帘子，见P96c。每个氢键串起的长度为3.6个肽平面或3.6个aa残基，被氢键串起来的这个环上含有13个原子，故?-右手螺旋也被称为3.613螺旋。
R基团对?-右手螺旋的影响：破坏者Pro，该处折断，因为亚氨基不能形成氢键；不稳定者酸性、碱性、太大、太小：Glu、Asp、Arg、Lys、Gly、Ile。其它都是起稳定作用的。
分布：毛发中的?-角蛋白，例如头发中的?-角蛋白。

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]  ... 下一页  >>