武汉大学生科院张楚富教授等原作！非常感谢！

第二章　　 氨基酸和蛋白质的一级结构
基本内容
蛋白质含有20种标准氨基酸，这些氨基酸在它们的α碳原子上分别含有一个氨基、一个羧基和一个侧链基团（或称R基团）。除甘氨酸外，所有其它氨基酸的α碳原子都是一个不对称的碳原子，即手性碳原子。蛋白质中的所有氨基酸都是L-型的。
20种标准氨基酸可以根据它们侧链的结构分为含脂肪烃基的氨基酸、含芳香基的氨基酸、含硫的（或含羟基的、或含酰胺基的）氨基酸。如果根据它们的侧链极性（或在生理pH下的解离），可分为侧链非极性氨基酸、侧链不带电荷的极性氨基酸和侧链解离带正电荷或负电荷的氨基酸。氨基酸侧链的性质对于决定蛋白质的性质、结构和功能来说是很重要的。
氨基酸的α-氨基和α-羧基都是可解离的基团，它们的解离取决于介质的pH。在生理pH下，α-氨基解离带正电荷（–NH3+），α-羧基解离带负电荷（–COO–）；侧链可解离基团的解离取决于它们的pK值和介质的pH。氨基酸的解离性质是建立分离和分析氨基酸的方法的基础，它们的解离也影响蛋白质的性质、结构和功能。分离分析氨基酸的主要方法是离子交换法以及电泳法。
蛋白质是由氨基酸借肽键连接而成多聚物。在蛋白质多肽链中，肽键是唯一的共价键，由一个氨基酸的α-羧基和相邻氨基酸的α-氨基脱水缩合而成。在多肽链中，氨基酸残基的顺序称为蛋白质的一级结构。
蛋白质是生物大分子，虽然它们具有与氨基酸相似的解离性质，但这一性质却比氨基酸复杂。蛋白质的许多重要的性质，例如，溶解性、极性、带电性质、分子大小以及配体亲和性等，是构成分离分析它们的方法的基础。离子交换法、凝胶过滤法、亲和层析法、超速离心法以及各种电泳法是常用的方法。
蛋白质一级结构的测定通常采用这样的程序，即纯净样品的末端分析、氨基酸组成分析、专一性酶或化学试剂进行部分水解、Edman降解法测定肽碎片的氨基酸残基的顺序以及片段重叠。末端分析常有丹磺酰氯法和二硝基氟苯法；肽链的部分水解一般是有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法以及溴化氰法。
氨基酸顺序的分析能揭示不同来源的蛋白质彼此之间的进化关系，亦为分子病的诊断提供可靠的依据。
第二章　　 氨基酸和蛋白质的一级结构
习题
2–1．图2—1的滴定曲线描述了谷氨酸的电离。请回答下列问题：①指出三个pK’a的位置；②指出Glu－和Giu＝各一半时的pH；③指出谷氨酸总是带净正电荷的pH范围；④指出Glu±和Glu－能作为一种缓冲液的共轭酸碱对的pH范围.

　　　　　　　　图2-1 谷氨酸的酸-碱滴定曲线

2–2．为什么甘氨酸处在等电点时是以偶极离子的形式存在，而不是以完全不带电荷的形式存在？处在等电点时，其完全不带电荷的形式是多少?
2–3．甘氨酸是乙酸甲基上的氢被氨基取代生成的，但是，甘氨酸羧基的pK’a值比乙酸羧基 pK’a低。为什么?
2–4．在pH9.0时，计算赖氨酸的两性离子、阳离子以及阴离子所占的比例。已知赖氨酸三个可电离基团α-COOH，α–NH3+和ε- NH3+的pK’a值分别为2.18、8.95和10.53。
2–5．用强酸型阳离子交换树脂分离下述每对氨基酸，当用pH7.0的缓冲液洗脱时，下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸?
①天冬氨酸和赖氨酸；②精氨酸和甲硫氨酸；⑧谷氨酸和缬氨酸;④甘氨酸和亮氨酸；⑤丝氨酸和丙氨酸。
2–6．计算出由Ala、Gly、His、Lys和Val所构成的可能的五肽数目。
2–7．在大多数氨基酸中，α–COOH的pK’a值都接近2.0，α–NH3＋的pK’a值都接近9.0。但是，在肽中，α–COOH的pK’a值为3.8，而α–NH3＋的pK’a比值为7.8。你能解释这种差别吗?
2–8．某蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD；用SDS-PAGE测定时，它的表观分子量是60kD，无论2-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确？为什么？
2–9．一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。
2–10．下面的数据是从一个八肽降解和分析得到的，其组成是：Ala、Gly2、Lys、Met、Ser，Thr、Tyr。该八肽
用CNBr处理，得到：①Ala、Gly、Lys、Thr； ②Gly、Met、Ser、Tyr
用胰蛋白酶处理，得到：①Ala、Gly； ②Gly、Lys、Met、Ser、Thr、Tyr
用糜蛋白酶处理，得到：①Gly、Tyr； ②Ala、Gly、Lys、Met、Ser、Thr
经分析，N–末端残基是：Gly
C–末端残基是：Gly
请确定该肽的氨基酸顺序。

第二章 氨基酸和蛋白质的一级结构
解答：
2–1解答: ①三个pK’a的位置如图2—4所示

图2–4 谷氨酸的酸-碱滴定曲线显示出它的三个
pK’a的位置以及它在不同pH下的电离状态
②Glu－和Glu＝各一半的pH值为9．67。
③当pH小于3.22时，谷氨酸总是带净正电荷。
④Glu±和Glu－作为一种缓冲液的共轭酸碱对的pH范围是pH4.25左右
2–2解答：因为羧基的酸性(pK’a=2.36)比质子化的氨基的酸性强得多(pK’a=9.60)。因此，羧基将倾向于供出质子使氨基质子化，并且其平衡常数是107。这表明平衡状态非常强烈地偏向右边：

因甘氨酸的等电点是5.97，首先我们需要测定甘氨酸处在等电点时〔–COO－〕/〔–COOH〕和〔H3+N–〕/〔–NH2〕的比例。如果我们单独处理每个功能基团，并利用Henderson—Hass- elbalch方程，就会得到：

两者合并起来考虑时，两性离子与完全不带电荷的比例是：

因此，甘氨酸处在等电点时，大约1／107以不带电荷的形式存在的。
2–3解答：甘氨酸羧基的pK’a值为2.34，乙酸羧基的pK’a值是4.7。当甘氨酸溶液的pH值低于6.0时，氨基以正电荷的形式存在。这种正电荷通过静电相互作用使带负电荷的羧基离子稳定。这就意味着甘氨酸的羧基将比较容易失去它的质子，因而它是一种更强的酸(具有更低的 pK’a值)。
2–4解答：赖氨酸有三个可电离的质子：

[Lys±]＝1.12[Lys＋]＝1.12×46.45＝52

由此可见，在pH9.0时，〔Lys＋＋〕含量甚微，可以忽略不计，〔Lys＋〕占46.45％，〔Lys＋－〕为52％，〔Lys－〕为1.53％，整个分子带部分正电荷。

2–5解答：氨基酸从离子交换柱上被洗脱下来的速度主要受两种因素的影响：①带负电荷的树脂磺酸基和氨基酸带正电荷的功能基团之间的离子吸附，吸附力大的在树脂上停滞的时间长，从柱上洗脱下来的速度慢；②氨基酸的侧链基团与树脂强非极性的骨架之间的疏水相互作用。非极性大的侧链R基氨基酸与树脂骨架间的疏水作用力强，从树脂柱上洗脱下来的速度慢。
　根据氨基酸可电离基团的pK’a值，我们可以确定题中每组氨基酸的结构以及在pH7时它们的平均净电荷。如果平均净电荷相同，则取决于它们侧链基团的疏水性。
　①天冬氨酸净电荷为–l，赖氨酸净电荷为+1；赖氨酸与树脂磺酸基相反离子吸附力大。因此，天冬氨酸先被洗脱下来。
　②精氨酸净电荷为+1，甲硫氨酸净电荷接近零。因此，甲硫氨酸先被洗脱下来。
　③谷氨酸净电荷为–1，缬氨酸净电荷接近零，谷氨酸的负电荷与树脂荷负电的磺酸基之间相互排斥，减小了谷氨酸与树脂的附着力，故先被洗脱下来。
　④甘氨酸和亮氨酸的净电荷都接近零，但亮氨酸庞大的非极性侧链与树脂骨架之间的非极性相互作用力大。故甘氨酸先被洗脱下来。
　⑤丝氨酸和丙氨酸的净电荷都接近零，但丝氨酸的侧链非极性小，故先被洗脱下来。
2–6解答：五肽的第一个残基是五个残基中的一个，第二个残基是余下四个残基中的一个，余此类推。因此，可能形成的五肽数目是：5×4×3×2×1＝120

2–7解答：在游离的氨基酸中，邻近的电荷影响每个基团的pK’a值。带正电荷的–NH3+的存在，使带负电荷的–COO－稳定，使羧基成为一种更强的酸．相反地，带负电荷的羧酸使–NH3+稳定，使它成为一种更弱的酸，因而使它的pK’a升高．当肽形成时，游离的α-氨基和α-羧基分开的距离增大，相互影响降低，从而使它们的pK’a值发生变化．

2–8解答：蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该是比较准确的，因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。

2–9解答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。

2–10解答： 根据CNBr、胰蛋白酶、糜蛋白酶水解该肽的结果，并结合组成及末端分析
CNBr：　 Gly-(Tyr、Ser)-Met　(Thr、Lys、Ala)-Gly
胰蛋白酶： Gly-(Tyr、Ser、Met、Thr)-Lys　 Ala-Gly
糜蛋白酶： Gly-Tyr　(Ser、Met、Thr、Lys、Ala)-Gly
根据片段重叠,推测该肽的顺序是:Gly-Tyr-Ser-Met-Thr-Lys-Ala-Gly
第三章 蛋白质的空间结构和功能
内容提要
蛋白质在一级结构的基础上可以形成二级、三级或四级结构。不同的蛋白质有不同的空间结构。一级结构是蛋白质空间结构形成的基础。X-射线晶体衍射和核磁共振是测定蛋白质以及其它生物大分子结构的有效方法。
肽基或肽单元是有极性的，也是一种具刚性的平面。N―Cα和Cα―C单键旋转的角度分别用φ和ψ描述。这两个角旋转的角度决定两个相邻肽基的空间位置。如果这两个旋转角分别相等，则多肽链主链是有规律的构象。在α螺旋和β折叠中，这两个旋转角都是分别相等的。因此，α螺旋和β折叠是有规律的构象。在α螺旋中，每轮卷曲的螺旋包含3.6氨基酸残基，同一肽链上的每个残基的酰胺氢和位于它后面的第4个残基上的羰基氧彼此之间形成氢键。这种氢键大致与螺旋轴平行。β折叠可分为平行式和反平行式两种类型，它们是通过肽链间或肽段间的氢键维系。
蛋白质的二级结构是指多肽链主链在空间中的走向，包括α螺旋、β折叠，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素。
蛋白质可分为纤维状蛋白和球状蛋白。纤维状蛋白通常是水不溶性的，在生物体内往往起着结构和支撑的作用；这类蛋白质的多肽链只是沿一维方向折叠。球状蛋白一般都是水溶性的，是生物活性蛋白；它们的结构比起纤维状蛋白来说要复杂得多。α螺旋和β折叠在不同的球状蛋白质中所占的比例是不同的。在球状蛋白质中，β转角、卷曲结构或环结构是它们形成复杂结构不可缺少的。
三级结构主要针对球状蛋白质而言的，是指主链和侧链在空间中的走向。在球状蛋白质中，侧链基团的定位是根据它们的极性安排的。蛋白质特定的空间构象是由氢键、离子键、偶极与偶极间的相互作用、疏水作用等作用力维持的，疏水作用是主要的作用力。有些蛋白质还涉及到二硫键。
在大多数球状蛋白质中，往往可以观察到可明显区分的二级结构组合。这种组合称为超二级结构或基元。基元也许具有结构和功能上的作用。例如二核苷酸结合部位常具有称为Rossmann折叠的βαβαβ组合形式。
分子较大的多肽常折叠成两个或多个球状簇，这种球状簇叫做结构域或域结构(domain)。大多数域结构由100～200个氨基酸残基构成，平均直径约2.5 nm 。一条多肽链在一个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。因而域在结构上是独立的、具有小分子球状蛋白质的特性的单位。域结构往往有特殊的功能，例如结合小分子。
蛋白质的折叠是有序的、由疏水作用力推动的的协同过程。伴侣分子在蛋白质的折叠中起着辅助性的作用。蛋白质多肽链在生理条件下折叠成特定的构象是热力学上的一种有利的过程。折叠的天然蛋白质在变性因素影响下，变性失去活性。在某些条件下，变性的蛋白质可能会恢复活性。
寡聚蛋白质是由两个或多个多肽（称为亚基）链装配而成的。在寡聚蛋白质中，亚基在空间中的定位或相互间关系构成了四级结构研究的内容。维持寡聚蛋白质稳定的力同样涉及氢键、离子键、偶极与偶极间的相互作用、疏水作用。
每一种蛋白质都有着特有的生物学功能，这是由它们特定的空间构象决定的。因为它们的特定的结构允许它们结合特定的配体分子，例如，血红蛋白和肌红蛋白与氧的结合、酶和它的底物分子、激素与受体、以及抗体与抗原等。
第三章 蛋白质的空间结构和功能
习题：
3-1．构象(conformation)指的是，一个由多个碳原子组成的分子，因单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基或原子的空间排列，只需单键的旋转即可造成新的构象。多肽链主链在形式上都是单键。因此，可以设想一条多肽主链可能有无限多种构象。然而，一种蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH下只有一种或很少几种构象，并为生物功能所必需。这种天然的构象是什么样的因素促成的?
3-2．假若一条多肽链完全由丙氨酸构成，什么样的环境促使它很可能形成α–螺旋，是疏水环境还是亲水环境?
3-3．以nm为单位计算α-角蛋白卷曲螺旋（coiled coil）的长度。假定肽链是由100个残基构成。
3-4．一种叫做Schistosoma mansoni 寄生虫的幼虫能感染侵入人的皮肤。这种幼虫分泌出能裂解的-Gly-Pro-X-Y-（X和Y可能是几种氨基酸中的任何一种）顺序中的X和Y之间肽键的酶。为什么该酶活性对这种寄生虫侵入是重要的。
3-5．①是Trp还是Gln更有可能出现在蛋白质分子表面？②是Ser还是Val更有可能出现在蛋白质分子的内部？③是Leu还是Ile更少可能出现在α-螺旋的中间？④是Cys还是Ser更有可能出现在β-折叠中？
3-6．下面的多肽哪种最有可能形成α-螺旋？哪种多肽最难以形成β-折叠？
①CRAGNRKIVLETY；②SEDNFGAPKSILW；③QKASVEMAVRNSG
3-7．胰岛素是由A、B两条链组成的，两条肽通过二硫键连接。在变性条件下使二硫
键还原，胰岛索的活性完全丧失。当巯基被重新氧化后，胰岛素恢复的活性不到天然活性的10%请予以解释。
3-8．对于密度均一的球状蛋白质来说，①随着蛋白质分子增大，其表面积／体积(A／V)的比例是增大还是减小？②随着蛋白质分子增大，其亲水侧链氨基酸残基与疏水侧链氨基酸残基的比例是增大还是减小?
　
3-9．胎儿血红蛋白（Hb F）在相当于成年人血红蛋白（Hb A）β链143残基位置含有Ser，而成年人β链的这个位置是具阳离子的His残基。残基143面向β亚基之间的中央空隙。①为什么2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）同脱氧Hb A的结合比同脱氧Hb F更紧？②Hb F对2,3-BPG的低亲和力如何影响到Hb F对氧的亲和力？③Hb F的P50是18托(torr)，Hb A的P50是26托。基于这两个数值如何解释氧从母亲血液有效转运到胎儿。
3-10．在生理条件下，多聚赖氨酸呈随机卷曲的构象。在什么条件下它可以形成α-螺旋？
3-11．某蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD；用SDS-PAGE测定时，它的表观分子量是60kD，无论2-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确？为什么？
3-12．请根据下面的信息确定蛋白质的亚基组成：① 用凝胶过滤测定，分子量是200kD；②用SDS-PAGE测定，分子量是100kD；③在2-巯基乙醇存在下用SDS-PAGE测定，分子量是40kD和60kD。
3-13．每分子人细胞色素c含有18分子的赖氨酸。100克细胞色素c完全水解得到18．7
克的赖氨酸。求细胞色c的分子量。
3-14．有一种混合液含有五种多肽(P1、P2、P3、P4和P5)，在pH8.5的条件下进行电泳分离，染色后揭示出如图2–6a的迁移图谱。已知这五种多肽的 pI是：P1为9.0，P2为5.5，P3为10.2，P4为8.2， P5为7.2。并且已知它们的分子量都接近1200。①请在图上鉴定出每条带相应的多肽；②现有一种pI为10.2的多肽(P6)，它的分子量大约为600。该肽若与上述五肽一起在pH8.5下电泳，请你指出它的位置。

　图2–6 几种蛋白质的电泳迁移图（a）和它们迁移的相对位置（b）
　

3-15．一种纯净的蛋白质样品用普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在pH8.2条件下进行分析鉴定，得到如图2–7(A)的结果。该蛋白质样品在用SDS处理后，接着用SDS-PAGE进行分析，得到如图2–7(的结果。通过对上述两种电泳结果的比较，关于该蛋白质的结构你将得出什么样的结论？该蛋白质的等电点是低于pH8.2还是高于pH8.2？
-16．一个蛋白质混合物含有下面几种不同的组分：
　a Mr＝12，000　pI=10；　b Mr=62，000　pI=4
c Mr＝28，000　pI=7；　 d Mr=9，000　 pI＝5
不考虑其他因素，分别指出在下述情况下被洗脱的顺序。　
①该混合物用DEAE-纤维素柱层折时，以逐渐增高洗脱液的盐浓度方式进行洗脱。
②该混合物用SephadexG-50凝胶柱层析分析。
　
3-17．一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。

第三章 蛋白质的空间结构和功能
解答：
3-1解答：①由于肽键因共振结构而使C—N键具有部分双键的性质，不能自由旋转，因而使得一条多肽主链构象的数目受到了极大限制。②与位于相邻刚性平面交线上的Cα相连接的侧链基团的结构、大小和性质对于主链构象的形成及稳定有很大的影响，使多肽链主链构象数目又受到很大的限制。因为Cα与两个刚性平面连接的单键的旋转度不同程度受到侧链的限制。③各种侧链基团相互作用所形成的各种力使蛋白质在热力学上达到了一种最稳定的构象。。
　
3-2解答；一条多肽链呈α-螺旋构象的推动力是所有肽键上的酰胺氢和羰基氧之间形成的链内氢键。在水环境中，肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部(α-螺旋内)的氢键，也能与水分子形成氢键。如果后者发生，多肽链呈现类似变性蛋白质那样的伸展构象。疏水环境对于氢键的形成不能提供任何竞争，因此，更可能促进α-螺旋结构的形成。
3-3解答：α-角蛋白的每条肽链呈α-螺旋构象，而每个α-螺旋含3.6个残基。在α-角蛋白中，每轮螺旋的长度为0.51nm。因此, α-角蛋白卷曲螺旋（coiled coil）的长度是：
（100残基÷3.6个残基/轮）×0.51/轮＝14.2nm
3-4解答：-Gly-Pro-X-Y-顺序频繁出现在胶原蛋白分子中，在身体的各部位都存在，包括皮肤。由于该幼虫酶能催化胶原蛋白多肽链裂解，故该寄生虫能进入宿主皮肤而生存。
3-5解答：蛋白质氨基酸残基在蛋白质结构中出现的位置与这些氨基酸残基的亲水性或疏水性相关。亲水性残基（极性残基）通常位于蛋白质分子的表面，而疏水性残基（非极性残基）通常位于蛋白质分子疏水的内部。①Gln是亲水性残基，它比Trp更有可能出现在蛋白质分子表面。②Val是非极性残基，它比Ser更有可能位于蛋白质分子的内部。③Ile在它的β碳位上有分支，不利于α-螺旋的形成，因此它通常不出现在α-螺旋中。④侧链小的氨基酸残基常出现在β-折叠中，因为这有利于片层的形成。所以Ser更有可能出现在β-折叠中。
3-6解答：多肽③最有可能形成α-螺旋，因为它的三个带电荷的残基(Lys,Glu,Arg)在该螺旋的一侧相间排成一行。一个有邻近碱性残基(Arg和Lys)的多肽会使螺旋去稳定。多肽②含有Gly和Pro，这两种氨基酸是螺旋的强破坏者。Gly和Pro的存在也会阻止β-折叠的形成。所以多肽②最难以形成β-折叠。
　3-7解答：胰岛素是以前体的形式合成的。前体分于是一条单一的肽链。在前体合成及折叠后，切除前体分子的一部分(包括连接肽C肽)，留下由二硫键连接的A和B两条肽链。这样，天然的胰岛素由于缺少C肽，因而也就缺乏指导肽链折叠的某些所必需的信息。所以当胰岛素变性和还原，随之复性，二硫键的形成是随机的。在这种情况下是不能完全恢复到天然活性的。这并不与氨基酸顺序指导蛋白质折叠的基本原则相矛盾。
3-8解答：①对于密度均一的球状蛋白质来说，随着分子量(即分子大小)增大，其半径(r)也增大。由于表面积＝4πr2，体积=4/3πr3，因此

从这个表达式来看，随着蛋白质分子量的增大，它的表面积／体积的比例减小了。即随着蛋白质分子的增大，体积的增大比表面积增大更快。
②由于极性基团的亲水性，大多数分布在球状分子的表面，非极性侧链基团的疏水性，大多数聚集在球状分子的内部．由于随着分子量增大而体积增大，内部空间也增大。因此内部就可以容纳更多的具疏水侧链基团的氨基酸残基。所以随着球状蛋白质分子量的增大，亲水侧链氮基酸残基与疏水侧链氨基酸残基的比例将减小。
3-9解答：①由于2,3-BPG是同脱氧Hb A中心空隙带正电荷的侧链结合，而脱氧Hb F缺少带正电荷的侧链（β链143位的His残基），因此2,3-BPG是同脱氧Hb A的结合比同脱氧Hb F的结合更紧。②2,3-BPG稳定血红蛋白的脱氧形式，增高脱氧血红蛋白的份数。由于Hb F同2,3-BPG亲和力比Hb A低，Hb F受血液中2,3-BPG影响小，分子的氧合形式的份数较大，因此Hb F在任何氧分压下对氧的亲和力都比Hb A大。③在20―40氧分压下，Hb F对氧的亲和力比Hb A大，亲和力的这种差别允许氧从母亲血向胎儿有效转移。
3-10解答：在生理条件下，赖氨酸残基的带增电荷的侧链彼此排斥，不能形成α-螺旋。当它所处环境的pH上升超过它的侧链可界离基团的pK（>10.5）时才能形成α-螺旋。
3-11解答：蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该是比较准确的，因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。
3-12解答：凝胶过滤分离的蛋白质是处在未变性的状态，如果被测定的蛋白质的分子形状是相同的或者是相似的，所测定的分子量应该是较准确的。SDS-PAGE测定蛋白质的分子量只是根据它们的大小。但这种方法能破坏寡聚蛋白质亚基间的非共价作用力，使亚基解离。在这种情况下，所测定的是亚基的分子量。如果有2-巯基乙醇存在，则能破坏肽链内或肽链间的二硫键。在这种情况下进行SDS-PAGE，所测定的分子量是亚基的分子量（如果亚基间没有二硫键）或者是肽链的分子量（如果亚基是由二硫键连接的几个肽链组成）。根据题中给出的信息，该蛋白质的分子量是200kD，由两个大小相同的亚基（100kD）组成，每个亚基由两条肽链（40kD和60kD）借二硫键连接而成。
3-13解答: 根据组分的百分含量求蛋白质的最低分子量可按下式计算：
　　　　
细胞色素c的真实分子量=最小分子量×某氨基酸数=684×18＝12300. 这一结果与用物理方法测定的结果很接近。　

3-14解答：①根据它们的等电点以及它们在pH8.5条件下所带净电荷的多少，很容易鉴定出它们在电泳图谱上的位置(图2-6b)。　
②P6与P3具有相同的pI，即是说，在pH8．5的条件下，它们带有等量的净电荷。但P6的分子量仅是P3的一半，它的迁移率是P3的2倍，电泳后它在支持物上位置应比P3更接近于负极(如图2-6b所示)。　　
(在一定粘度的介质中，在恒压下，带电颗粒的迁移率由电荷与颗粒大小的比例决定，即：μ（迁移率）∝（Q（电荷）/r（大小））。为了在Q／r基础上估计出相对迁移率，可用物质的分子量去除pI－pH，pI－pH视为Q值的一种量度。)
　
3-15解答：普通聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时主要是根据各组分的pI的差别。图2-7(A)的结果只呈现单一的带，表明该蛋白质是纯净的。
由于SDS是一种带负电荷的阴离子去垢剂，并且具有长长的疏水性碳氢链。它的这种性质不仅使寡聚蛋白质的亚基拆离，而且还能拆开肽链的折叠结构，并且沿伸展的肽链吸附在上面。这样，吸附在肽链上的带负电荷的SDS分子使肽链带净负电荷，并且吸附的SDS的量与肽链的大小成正比。结果是，不同大小的肽链将含有相同或几乎相同的Q／r值。由于聚丙烯酰胺凝胶基质具有筛分效应，所以，分子较小的肽链将比较大的、但具有相同的Q／r值的肽链迁移得更快。若蛋白质是由单一肽链或共价交联的几条肽链构成，那么在用SDS处理后进行SDS-PAGE，其结果仍是单一的一条带。若蛋白质是由几条肽链非共价结合在一起，在用SDS处理后进行SDS-PAGE，则可能出现两种情况：一种仍是一条带，但其位置发生了变化(迁移得更快)，表明该蛋白质是由几条相同的肽链构成，另一种可能出现几条带，则可以认为该蛋白质是由大小不同的几条肽链构成． 图2–7蛋白质的鉴定
图2-7(的结果表明该蛋白质是由两种大小不同的肽链借非共
价键结合在一起的寡聚体蛋白质。从图2–7的电泳结果我们可以断定该蛋白质的等电点低于pH8.2。
-16解答：①DEAE-纤维素是一种常用于蛋白质分离的阴离子交换剂。在分离蛋白质
样品之前，DEAE-纤维素先用较低的离子强度和pH为8的缓冲液平衡，蛋白质样品也溶于同样的缓冲液中。在这样的条件下，DEAE-纤维素大部分解离，并且带固定的正电荷。在这种pH下，蛋白质样品中各组分带净正电荷（但有差异，或带相反性质的电荷），这些带不同电荷的组分与DEAE-纤维素的结合力不同。洗脱液的离子强度影响带电颗粒与交换剂间的结合力。当升高洗脱液的离子强度时，会降低交换剂与被分离组分的静电吸引力。由上所述，该蛋白质混合物各组分被洗脱下来的先后顺序是:a>c>d>b。
②Sephadex是葡聚糖凝胶，它是具有不同交联度的网状结构，其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到．因此它具有筛分效应．用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是，分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出，分子比较小的蛋白质则因走了许多‘弯路”而被后洗脱下来。分子愈小，“弯路”走得愈多，洗出的速度愈慢。根据这一原则，上述蛋白质混合物从SephadexG–50洗脱出的顺序是：b>c>a>d。
　
3-17解答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。
第四章 酶
内容提要
酶是生物催化剂，能显著提高生物体内的化学反应速度。酶对它所作用的底物具有高亲和性和高度的专一性。酶是蛋白质，或者是由蛋白质和辅助因子组成。虽然发现有其它生物催化剂，例如具有酶活性的RNA，但这并不改变酶的蛋白质本质。根据酶催化反应性质，可将在生物体内发现的酶分为六大类。
酶的动力学描述的是酶在不同条件下催化反应的速度。酶催化反应的速度受底物浓度、温度、pH等的影响。米氏方程描述的是底物浓度对酶促反应速度的影响，这种影响呈现双曲线的图象。当底物浓度饱和时，酶促反应速度达到最大（Vmax）。米氏常数（Km）是指当酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。Km和Vmax可以通过双倒数作图法等方法获得。酶的催化常数或转换数(kcat)是指当酶被底物饱和时，每分子的酶（或酶的每个活性部位）在单位时间内催化底物转变成产物的底物分子数。当底物处在稀浓度或未饱和时，kcat / Km比是酶促反应的表观二级速度常数。kcat / Km为酶的催化效应和对底物的专一性提供了一种量度。
生物化学反应大多是多底物酶促反应。多底物酶促反应可分为有序顺次反应、随机顺次反应以及乒乓反应。多底物酶促反应动力学也是可以测定的。
对酶的抑制剂动力学研究具有重要的意义，可以帮助揭示酶活性部位的结构、分析和推测代谢反应途径以及为临床药物的设计提供依据。酶的抑制作用可分为可逆抑制和不可逆抑制两种类型。可逆抑制又可以分为竞争性、反竞争性和非竞争性抑制等不同类似类型。不同类型的抑制剂可以用动力学作图来区分。
酶对底物高度有效的催化源于酶和它的底物之间的多种弱的作用力的形成和相互作用所释放的自由能。这样的结合能既贡献于酶的专一性，又贡献于它的催化反应。在酶促反应的转换态中使这样的弱的相互作用处于最佳状态。酶活性部位本身与底物是不互补的，但与底物的转换态是互补的。酶与底物的邻近与定向以及转态的稳定是解释酶高效催化的主要因素。此外，广义的酸碱催化和共价催化对于解释酶促反应的高效性也是重要的。酶活性部位的氨基酸残基可以参与酸碱催化（质子的加入或移除）或共价催化。pH对酶促反应速度的影响可以提示什么样的残基参于了催化反应。
对溶菌酶和丝氨酸蛋白酶类作用机制的研究为洞察酶的作用机理提供了很好的范例。溶菌酶对细菌细胞壁的水解涉及底物的变形（由酶和底物之间多种弱的相互作用力所致）和中间物（转换态）的稳定。
许多丝氨酸蛋白酶以无活性的酶原形式合成，在适当的条件下通过选择性水解转变成有活性的酶。X-射线晶体衍射分析表明，蛋白质的三维结构能揭示出酶活性部位（包括专一性底物的结合部位）的信息。丝氨酸蛋白酶的活性部位含有一个由氢键结合网形成的Ser-His-Asp催化三联体。它的丝氨酸残基起着共价催化剂的作用，组氨酸残基起着酸碱催化剂的作用。带负电荷的四面体中间物由酶提供的氢键来稳定。
酶活性的调节是酶作为生物催化剂区别于非生物催化剂的重要标志，也是生物体内物质代谢的重要调节方式。酶活性调节包括酶原的激活、同工酶调节、别构调节和共价修饰调节。　
别构酶是多亚基酶，除含有底物结合部位外，还含有调节物结合部位（别构部位）。当调节物结合到别构部位时，诱导酶的构象发生变化，从而增高或降低酶的催化活性，进而调节代谢途径运行的速度。酶的共价修饰调节通常涉及酶分子特定部位的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化和去磷酸化。处在代谢途径关键部位的酶既具有别构调节又具有共价修饰调节两种调节方式。
第四章 酶
　
习题:

1．延胡索酸酶催化延胡索酸水合形成苹果酸，其逆反应苹果酸脱水转变成延胡索酸也能被该酶催化吗？为什么?

2．△G0'和△G‡两者与化学反应的关系是怎样的？

3．借助米-曼氏方程υ＝Vmax[S]/(Km＋[S])研究底物浓度对酶反应速度影响的一种有用的方法是，在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件下，方程呈什么形式？①当〔S〕=Km时；②当〔S〕>>Km时；③当〔S〕<

4．①为什么kcat / Km比值能用来测定一种酶对它不同底物的优先权？②什么是酶的kcat / Km上限？③ kcat / Km值接近上限的酶常被说成达到“完美催化”。请解释。

5．人类免疫缺于病毒Ⅰ(HIV-Ⅰ) 基因编码一种该病毒装配和成熟所必需的蛋白酶（Mr＝21500）。该蛋白酶能催化七肽底物水解，其kcat＝1000 s－1和Km＝0.075mol&#8226;L－1。(a) 当HIV-Ⅰ蛋白酶的浓度为0.2mg mL－1时，计算底物水解的Vmax；(b)当七肽的–CO–NH–替换成–CH2–NH–时，所得到的衍生物不能被HIV-Ⅰ蛋白酶水解，而却可以作为该酶一种的抑制剂。在如(a)所示的条件下，该抑制剂浓度为2.5μmol&#8226;L－1时，Vmax是9.3×10－3 mol&#8226;L－1 &#8226;s－1。该抑制作用属于哪种类型？

6．为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一系列的l00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟）所形成的产物量而获得催化反应的初速度，其结果如下表所示。
表4—2
　底物浓度　　初速度　　底物浓度　　初速度　　底物浓度　　初速度
(mol/L)　 (μmol/min)　　(mol/L)　 (μmol/min)　 (mol/L)　 (μmol/min)
　 1×10－6　　0.08　　 5×10－6　　 0.25　　 1×10－5　　 0.33
1×10－4　　0.48　　 1×10－3　　 0.50　　 1×10－2　　0.50
　
①把表中的数据绘制成图，在给出的酶量下的Vmax是多少?
②根据米-曼氏方程，用Vmax、υ和〔S〕推演出Km的代数表达式。计算每个反应混合物的Km。 Km值取决于底物浓度吗?
③当底物浓度为0.1mol&#8226;L－1和l×l0－7mol&#8226;L－1时，计算它们的初速度。
④反应混合物保温2分钟后确定反应的初速度。当初始底物浓度为1×10－2mol&#8226;L－1时，计算产物的生成量。在2分钟后底物总量的百分之几被转换?
　　　　　
7．许多酶都表现出类似钟罩形的pH-活性依赖曲线。但是，不同的酶具有不同的活性最高点，即不同的最适pH。请你举例说明pH对酶活性影响的原因。

8．研究某抑制剂对单底物酶催化反应的影响，获得如下表的结果。

①该抑制剂是竞争性还是非竞争性抑制剂?
②在无抑制剂存在时，该酶促反应的Vmax和Km是多少?
③在有抑制剂存在时，该酶促反应的Vmax和Km是多大?
④该反应的抑制常数（Ki）是多少?

9．十烷双胺((CH3)3+N—CH2—(CH2)8—CH2－N+(CH3)3)，一种用于肌肉松弛的药物，是乙酰胆碱酯酶的可逆的竞争性抑制剂。通过增高乙酰胆碱的浓度可使抑制逆转或解除。十烷双胺共价地同酶结合吗？为什么这种抑制作用可通过增高乙酰胆碱的浓度而被解除?
　
10．二异丙基氟磷酸（DIFP）可使乙酰胆碱酯酶不可逆失活。但是，

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