稳定期细胞内开始积累贮存物，此阶段收获菌体，也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段。
延长：补料，调pH、温度等。
此时，菌体总数量与所消耗的营养物之间存在一定关系，称为产量常数（生长效率）。Y = X - X0 /C 其中X-稳定期细胞干重/ml， X0 -接种时干重/ml，C-限制性营养物浓度。
根据这一原理，可进行生物测定。
将未知混合物加到只缺乏特定限制性营养物的完全培养基中，测定培养基所能达到的生长量，就可以计算出原混合物中特定限制性营养物的浓度。
（四）衰亡期 decline phase
表现：出现 “负生长 ”，有些细胞开始自溶。
对于丝状真菌，细胞数目不呈几何级数增加，无对数生长期，一般有调整期，最高生长期，衰退期。
四、连续培养 continuous cultivation
分批培养 batch culture ：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。
若不断补充新鲜营养，并及时不断以同样速度排出培养物，则可延长对数期。
只要培养液的流动量能使增殖的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证总菌量不变，此即连续培养原理。
主要参数：D（稀释率）=F（流动速率）/V（容积）
连续培养方法
1、恒浊连续培养 turbidostat
不断调节流速使培养液浊度保持恒定。
装置
适用：收获菌体及与菌体相平行的产物。
2、恒化连续培养 chemostat
恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。培养基成分中，必须将某种必需的营养物控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其它营养物过量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生长因子、无机盐等。
适用；科研
两种方法比较：
五、同步生长 synchronous growth
概念：使所有的细胞都能处于同一生长阶段，同时分裂的生长方式。
同步培养法获得：
（一）机械法（选择法）
1、离心沉降分离法
2、过滤分离法
3、硝酸纤维素薄膜法
（二）调整生理条件法（诱导法）
1、温度调整法：亚适生长温度-->最适生长温度培养。
2、营养条件调整法：控制浓度或组成，使细胞只能进行一次分裂。
3、用稳定期的培养物接种：稳定期细胞处于衰老状态，移入新鲜培养基，可得同步生长。
（三）抑制DNA合成法
DNA合成是细胞分裂前提。抑制一段时间再解除抑制。
3节：环境条件对生长影响
一、温度
影响两方面。
最低、最适、最高生长温度，致死温度。
微生物生长温度类型：
低温型（嗜冷微生物）
中温型（嗜温微生物）
高温型（嗜热微生物）
二、pH
主要影响：引起膜电荷变化，从而影响营养吸收；影响酶活性；改变营养物状态和有害物毒性。
有最适pH，此时酶活性最高，其他条件适合，生长速率最高，但不是生产的最适pH。
微生物细胞内的pH多接近于中性。
pH调节措施：
三、氧化还原电位 Eh
Eh与氧分压有关，也与pH有关。
不同种类微生物所要求的Eh不同。
Eh影响酶活性，也影响呼吸作用。
四、辐射
指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能量。
（一）紫外线（非电离辐射）10-380nm
致死主要是细胞中很多物质对紫外线吸收。杀菌作用随剂量增加而增加。紫外线穿透力弱，应用于空气消毒、表面消毒、菌种诱变。
（二）电离辐射（X、α、β、γ）
效应无专一性， α、β穿透力较弱，X、 γ较强。
KI对电离辐射具保护作用。
五、干燥
水分对正常生长必不可少，各种微生物抵抗干燥能力不同。
六、渗透压
微生物对渗透压有一定适应能力。高渗溶液—质壁分离，低渗溶液—细胞膨胀破裂。
七、超声波（20，000Hz以上）
使细胞破裂，科研中破碎细胞。
八、表面张力
4.5--6.5x10-4 N/cm，降低影响。
4节：灭菌与消毒
灭菌 sterilization ：杀死所有微生物。
消毒 disinfection ：杀死一切病原微生物。
防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生长繁殖。
化疗 chemotherapy：利用具有选择毒性化学药物或抗生素来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗的一种措施。
一、常用灭菌消毒方法
1、干热灭菌法
火焰灭菌（灼烧灭菌）、干热灭菌
2、湿热灭菌
巴氏消毒、煮沸消毒、高压蒸汽灭菌、间歇加热灭菌、实罐灭菌
3、过滤除菌
4、放射线灭菌
二、常用的消毒剂
理想的消毒剂：杀菌力强，使用方便；价廉；对人、畜无害；能长期保存；溶解度大；无腐蚀性等。
消毒剂种类：氧化剂、重金属盐、有机化合物
相对药效：
三、影响灭菌与消毒因素
1、微生物种类
2、培养基
3、消毒剂
4、环境因素
5节：化学疗剂对微生物作用
能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物。
化学疗剂能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。
一、抗代谢物
结构上类似，竞争性地与酶结合，只有当正常代谢物量少或不存在时才起作用。
最常用的是磺胺类药物。是氨苯磺胺衍生物，其结构与对氨基苯甲酸（PABA）类似，而PABA是叶酸分子组成。叶酸是辅酶，在氨基酸、维生素合成中起重要作用，许多细菌需自己合成叶酸，而人和动物利用现成叶酸，因此不受磺胺干扰。
还有异烟肼rimifon，是吡哆醇对抗物。
二、抗生素
作用范围：抗菌谱
作用位点：
1、抑制细胞壁合成：青霉素，多氧霉素
2、影响细胞膜功能：多肽类，多烯类
3、干扰蛋白合成：抑制而非杀死
4、阻碍核酸合成：对细胞有毒
三、微生物抗药性
对药物的适应性即是抗药性。
抗药性主要表现（产生机制）
1、菌体内产生钝化或分解药物的酶
2、改变膜的透性而导致抗药性产生
3、被药物作用的部位发生改变
4、形成救护途径。
五章：微生物遗传
遗传heredity—亲代将其特有的生物学特性传递给子代。
遗传性—子代总保持与亲代相同的生物学特性。
遗传型genotype—生物体所具有的全套遗传物质总称。又称基因型。
表型phenotype—特定环境中生物体表现出的种种形态与生理特征。
变异variation— 遗传型的改变。
适应或饰变modification—表型的改变。
基因—指带有足以决定一个蛋白质全部组成所需信息的最短DNA片段。
菌株&克隆—指一组遗传型相同的细胞群。
微生物在遗传上特点：
1、微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。
2、很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。
3、对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。大多是无性生殖，变异易保留。
1节：遗传变异的物质基础
一、证明经典实验
（一）转化实验
1928，Griffith首次发现Streptococcus pneumoniae的转化现象。
1944，Avery等在离体条件下重复这一实验，并对转化本质进行了研究。
终于证明了DNA是遗传物质。
Griffith转化实验：
Avery转化实验
（二）噬菌体T2的感染实验
1952，Hershey & Chase 用E. coli, phage T2做材料，利用同位素示踪法进行实验。
蛋白质只含S不含P，DNA只含P不含S，分别用35S、32P标记E. coli, 用T2感染，得到35ST2、32PT2。
实验过程（插入）
（三）病毒拆开与重建实验
1956，Fraenkel & Conrat 用TMV（烟草花叶病毒）和HRV（霍氏车前病毒）进行实验，说明遗传信息在RNA中。
（插入）
二、遗传物质在细胞中存在方式
（一）细胞水平
（二）核水平（plasmid）
（三）染色体水平
（四）核酸水平
（五）基因水平（遗传功能单位）
（六）密码子水平（遗传信息单位）
（七）核苷酸水平（最低突变或交换单位）
染色体外遗传物质—质粒
染色体外，独立存在的，能自主复制的遗传物质。
双股环状DNA，可游离存在，也可整合到宿主DNA上。
吖啶类染料、高温、某些离子作用可消除质粒。
附加体episome：质粒插入到染色体上和染色体一起复制。
质粒种类
1、F因子（致育因子）：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr.
2、R因子（耐药性）：痢疾杆菌，多价耐药性，耐药信息携带在质粒上。
3、Col因子（大肠杆菌素产生因子）
4、青霉素酶质粒
5、Ti质粒（诱癌质粒）：植物根癌，植物基因工程重要载体。
6、降解质粒：Pseudomonas
隐蔽质粒、表达质粒、分泌质粒等。 ←
2节：基因突变
突变mutation—遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化。
包括基因突变（点突变）—由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起。
染色体畸变—DNA的大段变化现象，表现为插入、缺失、重复、易位、倒位。
由于重组或附加体等外源遗传物质的整合而引起的DNA改变，不属突变范围。一、基因突变
（一）类型
按突变体mutant表型 特征不同
1、形态突变型：细胞或菌落形态改变。
2、生化突变型：代谢途径变异
营养缺陷型—由基因突变引起某酶合成能力丧失，必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能生长。
抗性突变型—能抵抗有害理化因素，包括抗药性、抗噬菌体等。
抗原突变型—细胞成分尤其是表面成分的细致变异。
3、致死突变型：基因突变导致个体死亡。
4、条件致死突变型：在某一条件下呈现致死效应，如温度敏感突变型。
如果从研究者能否从巨大群体中迅速检测和分离出个别突变体的目的来看，则只有两类突变：
选择性突变—具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长，从而取代原始菌株。
非选择性突变—无选择性标记，而只有一些性状的数量差别，如菌落大小、颜色深浅、代谢物产量等。
（二）特点
1、不对应性：
突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。
相应的环境仅起着淘汰原有非突变型个体的作用，如果说其有诱变作用，也可以诱发任何性状的变异，而不是专一性地诱发一种变异。
2、自发性：
各种突变可以在没有人为的诱变因素下自发发生。
3、稀有性：
自发突变频率较低，一般10-610-9 。
突变率— 每个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。或每单位群体在繁殖一代过程中形成的突变体的数目。
一个细胞长大分裂成两个细胞的过程称为细胞世代。
细胞世代数=n-n0, 对于非同步生长来说，对数生长期，平均世代数= n-n0 /Ln2, m 为n-n0 期突变体数目，
突变率= m
n-n0 /Ln2
测定m的简单办法是将一细胞群体培养在平板上，让突变在平板培养中发生。这种情况下，每一突变产生一固定在原位的突变体克隆，经适当处理可以以单一菌落状态检出。
非选择性突变的突变率很难测定。
4、独立性：
突变的发生一般是独立的，某一基因的突变，既不提高也不降低其他基因的突变率。突变不仅对某一细胞是随机的，而且对某一基因也是随机的。
5、诱变性：
诱变剂作用可提高突变率。
6、稳定性：
遗传物质结构发生的稳定变化，因而产生的新性状也是稳定的，可遗传的。
7、可逆性
野生型突变型，为正向突变
野生型突变型，为回复突变（回变）。
（三）自发性与不对应性的证明
突变是通过适应而产生的，突变的原因与性状间是相对应的。
突变是自发的，与环境是不相对应的。
1、变量试验（1943，Luria & Delbruck）
实验要点：（插入）
结果：甲各皿抗性菌落数相差较大，乙各皿数基本相同。
说明：抗性突变不是由噬菌体诱导出来的。
如果是噬菌体诱导的话，结果会怎样？
突变发生在什么时间？
噬菌体起什么作用？
2、涂布试验（1949，Newcombe设计）
实验要点（插入）
说明：抗性突变发生在未接触噬菌体之前，噬菌体加入只起筛选作用。
如果不是这样，结果会怎样？
3、影印培养试验（1952，Lederberg设计）
影印培养法—使在一系列培养皿相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法。
利用此法可以从在非选择性条件下生长的群体中，分离出各类突变体。
实验要点：（插入）
结果：3上出现抗性菌落，在2上找出相应菌落接种到含药平板上，长出抗性菌落。而取与3上无对应关系的菌落接种到含药平板上则无生长。 （四）突变机制
1、诱变机制 induce mutation , mutagen
1）碱基对置换（点突变）
只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，分为转换和颠换。
①直接引起置换的诱变剂
可直接与碱基发生反应，不论在体内还是离体都起作用。包括亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯、NTG等）。
以HNO2为例：
HNO2 可使碱基氧化脱氨，使A→H，C→U，G→X。
AT→HeT HkC HkC
②间接引起置换的诱变剂
一些碱基结构类似物，但稳定性比正常碱基小，易发生互变。通过活细胞的代谢活动掺入到DNA中，只对正在生长发育的细胞有作用，即DNA复制时起作用。
主要是5-BU，5-AU，2-AP，8-NG等。
以5-BU为例：
AT A:5-BU(酮式） AT GC
AT G:5-BU(烯醇式） A:5-BU(酮式）
还可以看出5-BU掺入引起GC回复至AT的过程。碱基对置换对密码子影响
简拼 UCG(Ser)（不表现突变现象）
错义 UAC(Tyr)
UCC 错义 UUC(Phe) (所合成蛋白质
(Ser) 有活性或纯化)
无义 UAA(终止符)（合成一些蛋白质碎片）
2）移码突变
由一种诱变剂引起DNA分子中一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部密码的转录和转译发生错误。也属于DNA分子的微小损伤。
主要是吖啶类染料，一系列ICR化合物。
在DNA链上增缺1、2、4、5碱基，可引起移码突变，增缺3、6，则不影响读码，只引起短的缺、增。
3）染色体畸变
DNA分子大的损伤。
①数量变化：真核有倍数性变化和非倍数性变化；原核只一条染色体，获得一段DNA，形成部分二倍体。
②结构变化：又分染色体内与染色体间畸变（非同源染色体间易位）。
4）转座因子 transposible element
1940`s B. McClintock 玉米遗传研究发现染色体易位。
在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA序列称作转座因子。
有三类：
插入序列 IS：0.7-1.4 kb，只能引起转座效应，不含其它基因。
转座子 Tn ：2-2.5 kb，含有几个至十几个基因。
Mu噬菌体：37 kb，含有20多个基因。 2、自发突变机制
Spontanous mutation：指微生物在没有人工参与下发生的突变。
1）背景辐射和环境因素的诱变：低剂量长期效应。辐射、高温、低浓度诱变剂。
2）自身代谢产物的诱变：H2O2—内源诱变剂。
3）互变异构效应：T、G酮式或烯醇式，A、C氨基式或亚氨基式。一般倾向于酮式和烯醇式。T以烯醇式与G配对，C以亚氨基式与A配对。
4）环出效应：DNA复制过程中偶尔环出。
（五）紫外线对DNA的损伤及机体对损伤DNA的修复

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