结构：P111上   5肽

主要重复单位： 

侧链Ｒ：由不同的氨基酸残基构成 
名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸
写法： Ｎ Ser-Gly--Try-Ala---Leu或ＳＧＹＡＬ，如果倒过来写，则表示不同的肽，如Leu—Ala---Tyr---Gly---Ser。
肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。

图P111 下  肽键结构

结构１中，Ｃ－Ｎ单键长0.148nm
结构２中，Ｃ＝Ｎ双键长０.127nm
结构３中，Ｃ--Ｎ键长0.132nm，６个原子几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
肽键结构介于１和２之间（结构3），是结构1和结构2之间的平均中间状态。Ｃ－Ｎ单键具有的40%的双键性质，C═O双键具有40%的单键性质。
（3）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（4）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．

图

二、 肽的重要性质
1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。
2、 肽的酸碱性质
短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。
在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
肽中的末端α－COOH pK值比游离 a.a中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的pK值比游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。
pK值改变的原因：
见Ｐ113、表３－８，比较表３－８中Gly-Gly和Gly-Gly-Gly


Gly—Glu—Lys—Ala的解离：

图   P113

pH    占优势离子的净电荷：
〈3.5         +2
3.5-4.5        +1
4.5-7.8         0
7.8-10.2       -1
〉10.2         -2
注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。

问题1：求出二肽Lys—Lys 及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。

图

将Ｒ＋＋— 变成Ｒ＋—，就必须考虑R＋—与R（+  ，+  ，-1）等同，即侧链—N+H3解离50%，此时
图

Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离，它的R+-实际相对于R（+    ，+   ，+     ， -1  ），此时每个侧链解离后带有 1/3个正电荷。


问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）

多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。
多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中），但残基数增大时，此法不行。可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较，推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳进行实验测定。
3、 肽的化学反应
和游离氨基酸一样，肽的α—羧基，α—氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。

图

三、 天然存在的活性肽
生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。
生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。
活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。
很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。
1、 谷胱甘肽    Glu—Cys—Gly
广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。
   2GSH              GS—SG

   H2O2 + 2GSH           2H2O + GS—SG
2、  短杆菌肽（抗生素）
由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。

     L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro—L-Val
3、 脑啡肽（5肽）
已发现几十种
      Met--- 脑啡肽：  Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
      Leu----脑啡肽：   Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有镇痛作用。

1982年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了Leu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
     《神经生物化学》 神经多肽
生物体内多肽或寡肽的来源：
①合成蛋白质的剪切、修饰
②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、
③动物肠道可吸收寡肽
第四节 蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
一、 蛋白质结构层次
                一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
                    ↓   是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
                 二级结构
                        ↓
                    超二级结构
                        ↓
构象（高级结构）     结构域
                    ↓
                  三级结构(球状结构)
                    ↓
                  四级结构(多亚基聚集体)


一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)
二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。
超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。
结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。
三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。
或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。
四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。
单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。

                                 
                                       RNase
                          单条肽链     肌红蛋白
               单体蛋白                胰岛素
                          多条肽链     胰凝乳蛋白酶
      蛋白质                       
                            相同亚基 一种乳酸脱氢酶α4
              
                寡聚蛋白         
                             不同亚基 血红蛋白α2β2

蛋白质一级结构(序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。

二、 一级结构的要点
蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。
一级结构要点：
⑴蛋白质中的肽键都是由α-NH2和α-COOH结合生成的。
⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。
⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。
⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个α-NH2 和α-COOH
⑸分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。                              
三、 ．蛋白质一级结构测定
                      推断                       预测
氨基酸序列（一级结构）  →  空间结构 （高级结构）  → 功能     
（一） 蛋白质测序的一般步骤
祥见 P116
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 测定多肽链的氨基酸组成。
（4） 断裂链内二硫键。
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
（二） 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
1、 直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
              N                          C
      A 法裂解  A1    A2     A3     A4     
      B 法裂解  B1    B2     B3     B4  

用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测600-800bp
（三） 测序前的准备工作
1、 蛋白质的纯度鉴定
纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
2、  测定分子量
        用于估算氨基酸残基n=

方法：凝胶过滤法、沉降系数法
3、 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS        SDS-PAGE测分子量   
⑵二硫键结合
        过甲酸氧化：
         —S—S—+HCOOOH  →   SO3H
      β巯基乙醇还原：

举例:： 血红蛋白 (α2β2) 
        （注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
            分子量：  M
            拆亚基：  M1 、M2       两条带
          拆二硫键：  M1 、M2       两条带
      分子量关系：  M = 2M1 + 2M2
4、 测定氨基酸组成
主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
     对二甲基氨基苯甲醛  590nm。
②Cys 测定
     5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm
5、 端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH     无水肼NH2NH2  100℃  5-10h。
                                
                          A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、  D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
        N   H2N… … … … …Val—Ser—Gly   C

图 P118  羧肽酶法测C末端

（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1、 化学裂解法
       ①溴化氰              —Met—X—   产率85%
       ②亚碘酰基苯甲酸      —Trp—X—   产率70-100%
       ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
       ④羟胺NH2OH         —Asn—Gly—
        约150个氨基酸出现一次
2、 酶法裂解
①胰蛋白酶         Lys      X
    (X ≠ Pro)           
                      Arg—— X


②胰凝乳蛋白酶     Tyr——X
     (X ≠ Pro)        
                      Trp——X

                      Phe——X

胃蛋白酶
                   Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)

③Glu蛋白酶       Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶       Arg——X

⑤Lys蛋白酶       X——Lys

⑥Pro蛋白酶       Pro——X
3、 肽段的分离纯化
①电泳法   ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
        根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
        根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
        根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
4、 肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
（五） 肽段的序列测定及肽链的拼接
1、 Edman法
一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
        PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃      PTC——A-B-C-D……

（2）裂解
        PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸        ATZ—A  +  H2N—B-C-D

（3）转化
        ATZ—A                  PTH—A
           用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
                    耦联：得PTC肽
        一次循环    裂解：ATZ- a.a
                    转化：PTH-a.a
        反应产率   99％   循环次数    120
        (偶联、降  98%                60
        解两步）   90%                40
2、 DNS-Edman法
用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
       Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
       图
3、 有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
4、 用自动序列分析仪测序
仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
               自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
              表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
              用Polybrene反应器。
       （聚阳离子）四级铵盐聚合物
        液相：5nmol    20-40肽    97%
        气相：5pmol     60 肽     98%
5、 肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H    Ｃ端Ｓ
        Ａ法裂解：ONS  PS  EOVE  RLA  HOWT
        Ｂ法裂解：SEO  WTON  VERL  APS  HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
（六） 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
1、 二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质
第一向电泳
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳
分离出含二硫键的两条短肽，测序
与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
2、 酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是  Leu+    Pro0    Val-
        此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
3、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷  -0-糖苷
脂类：Ser、 Thr、Cys
磷酸：Ser、 Thr、His
经验性序列：  Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
四、 蛋白质的一级结构与生物功能
（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能
蛋白质一级结构举例：
（1） 牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128  图3-38 
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键           A.Cys 7 — B Cys 7
                               A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）

P128 图3-39
分子量：12600
        124个a.a残基
        4个链内二硫键。


牛胰RNase变性一复性实验：
P164    图3-69。

(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。

（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构  

P129  图3-40

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