4、 DNA的几种复制方式
（1）、 直线双向复制
单点，双向，T7
多点，双向，真核染色体DNA
（2）、 θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.）
（3）、 滚环复制：环状单链DNA，Φx174
（4）、 D环复制：线粒体、叶绿体DNA
（5）、 多复制叉复制：
第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。
在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA的复制最快可达50Kb/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。
三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子
目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制
（一） DNA的聚合反应和聚合酶
DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5，
1、 DNA聚合反应必备的条件
⑴ DNA聚合酶
⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板)
⑶引物  (DNA、RNA或蛋白质)
⑷ 4种dNTP
⑸ Mg2+ 
2、 聚合反应过程及特点
总反应式：
n1dATP          DNA pol .        dAMP
n2dGTP  +DNA                   dGMP          DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi
n3dCTP           Mg2+           dCMP
n4dTTP                           dTMP

P329 图19-10         P330图19-11

在链的延长过程中，链的游离3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。
DNA聚合酶的反应特点：
⑴ 以4种dNTP为底物
⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。
⑶ 反应需有引物3，-羟基存在
⑷ 链生长方向5， → 3，
⑸ 产物DNA的性质与模板相同
3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型
       P331图19-12      
（1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3＇羟基端回折成引物链。
（2） 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3’末端突出作为模板。
（3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。
（4） 环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。
4、 E.coli  DNA聚合酶
（1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell）
单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ
催化活性：
5， → 3， 聚合活性
3， → 5， 外切活性
5， → 3， 外切活性
用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得：
大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。
小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。
Klenow片段的用途：
a 补齐DNA 3，隐缩未端
b. 标记DNA片段未端
c．cDNA合成第二链 
d．d DNA测序
（2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell）
单体酶，分子量120Kd
催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)
           3，→ 5，外切
可能在DNA的修复中起某中作用。
（3）、  E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell）
寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。
P334表10-3

DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)
Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于单链DNA。

P334   表19-2  E.coli三种DNA聚合酶的性质比较


★DNA聚合酶有6个结合位点
     ⑴ 模板DNA结合位点
     ⑵ 引物结合位点
     ⑶ 引物3，-OH位点、反应位点
     ⑷ 底物dNTP结合位点
     ⑸ 5， → 3， 外切位点(pol.Ⅱ没有)
     ⑹ 3， → 5， 外切位点(校正)
5、 真核生物DNA聚合酶
P334 表19-4  真核生物DNA聚合酶

真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。
   ⑴ DNA聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA复制酶。
   ⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。
   ⑶ DNA聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。
   ⑷ DNA聚合酶δ，特点：有3， → 5，外切活力

（二） 引物酶或RNA聚合酶（引发酶）
细胞内，DNA的复制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。
★DNA复制为什么要用RNA引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）
P338
⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配
⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。
（三） 解螺旋酶
大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。
解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。
（四） DNA旋转酶
属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。
拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。
拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。
拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。
（五） 单链DNA结合蛋白（SSB）
复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。
（六） DNA连接酶（ligase）
连接双链DNA上的切口。
大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。
E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源。
（七） DNA复制的拓扑结构

P338-339
四、 DNA的半不连续复制
P336  图19-15     DNA的半不连续复制
DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。
前导链：
滞后链：
1968年，发现冈崎片段。长度：
细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。
真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。
五、 DNA复制过程（E.coli.）
P342  图19-17  大肠杆菌的复制体结构示意图
1、 复制的起始
引发：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。
引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）构成的复合体，负责RNA引物的合成。
引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

E.coli.DNA复制原点ori C，由245bp组成，三组13bp重复序列（近5，端处），四组9 bp重复序列（另一端处）。

图

大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：
DNaA                在原点处打开双螺旋
DNaB                使DNA解旋
DNaC                DNaB结合在原点所需
Hu                   刺激起始
引物酶（DNaG）      合成RNA引物
SSB                  结合单链DNA
RNA聚合酶           促进DNaA活性
旋转酶                松驰DNA扭曲应力
20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。
三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。
DnaB（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链。
2、 DNA链的延长反应
前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。
复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。
复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。
3、 RNA引物的切除及缺口补齐
DNA polⅠ的5， → 3，外切活力，切除RNA引物。
DNApolⅠ的5， → 3，合成活性补齐缺口。
4、 DNA切口的连接
DNA ligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。
5、 DNA合成的终止
环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。

u 小结：
⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。
⑵ SSB结合于DNA单链。
⑶ DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。
⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。
⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。
⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。
⑺ DNA ligase连接一个冈崎片段。
DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。
六、 真核生物DNA的复制    P343
1、 复制起点和单位
真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。

★试验证据：5-氟脱氧胞苷标记

真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟1-3Kb，细菌每分钟5Kb。
真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只利用一部分复制起点。
2、 复制过程中组蛋白的装配
核小体的结构（200bp左右）
在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。
★试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察
3、 真核生物DNA复制的终止
端粒：一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。
功能：
⑴保证线性DNA的完整复制
⑵保护染色体末端
⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。
端粒（telomeres）分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列，形式为：5，（TxGy）n3，(AxCy) n，x和y一般为1—4。
端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端。
端粒酶含有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约159b，含有多个CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。
人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。

⑴杂交
   图

⑵聚合
   图

⑶转位再杂交
   图

⑷进一步聚合
   图

⑸非标准GG配对
     图
        
七、 DNA复制的调控
八、 DNA复制的真实性
《杨岐生》P144
生物体DNA复制具有高度真实性，复制107-1011碱基对,只有一个错误碱基。
碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2 。
1、 DNA聚合酶对碱基的选择作用
酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP能长时间停留，而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。
酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。
动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。
DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板—引物，另一种是dNTP。
DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。
2、 3，→5，外切活性的校正阅读
E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。
缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成时，出现错误的几率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。
    图

3、 影响DNA合成真实性的因素
    ⑴高浓度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP)
   NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3，→5，外切活性。
    ⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3，末端离开外切活性中心。
    ⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3，→3，外切活性。
4、 为什么用RNA引物
⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配
⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。
第二节 DNA的损伤及修复
DNA的损伤，《罗纪盛》P428

一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。
紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC），使复制、转录受阻。
P346图19-22
细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上的损伤，恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。
一、 直接修复
1949年已发现光复活现象，可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。

P347 图19-23 紫外线损伤的光复活过程

A  形成嘧啶二聚体    B. 光复合酶结合于损伤部位     C  酶被可见光激活    D. 修复后释放酶
二、 切除修复
P348 图19-24  DNA损伤的切除修复过程

在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。
I、结构缺陷的修复：
（1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。
（2）核酸外切酶切除损伤的DNA。
（3）DNA聚合酶修复。
（4）DNA连接酶连接。
    图
II、无嘌呤无嘧啶——碱基缺陷或错配——脱碱基（N-糖苷酶）：
甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使DNA脱嘌呤。
DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP掺入DNA链。细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉次黄嘌呤。
对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法：
（1） AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修复，DNA连接酶连接。
（2） 插入酶插入正确碱基三、 重组修复
P349图19—25重组修复的过程

切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。
在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。
重组修复至少需要4种酶组分。
重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。
recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。
此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。

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