第五节 核酸研究技术
一、 核酸的分离纯化
要求：尽可能保持其天然状态。
       条件温和，防止过酸、过碱。
      避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。
1、 DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。
2、 RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）
用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。
去蛋白：盐酸胍、苯酚等
必须防止RNA酶对RNA的破坏。
二、 核酸的凝胶电泳
1、 琼脂糖电泳
① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比
② 凝胶浓度
③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。
④ 电流，不大于5V/cm
2、 PAGE电泳
三、 限制性核酸内切酶（1979年发现）
1、 限制修饰系统
         图

2、 II型核酸内切酶
核酸内切酶有I、II、III三种类型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。
II型酶的特点：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。
II型酶的切割频率
识别位点 4       44=256
                6       46=4096
                8       48=65536

Not I    GCGGCCGC
限制酶的命名：E.coRI
第一位：      属名E（大写）
第二、三位：  种名的头两个字母小写co
第四位：      菌株R
第五位：      罗马字，从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。
同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。
BamH：  GGATCC       同裂酶 BstI
识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。
同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。
BamHI：GGATCC
同裂酶：BstI GGATCC

同尾酶：BclI  TGATCA   BglII  AGATCT 

MboI  GATC    Sau3A  GATC
星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。

例如  HindIII   AAGCTT

四、 DNA物理图谱及构建
（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）
在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础，末端标记法构建DNA物理图谱：
（1）单酶完全降解和部分降解
（2）双酶降解

         图
五、 分子杂交
1、 Southern Blotting
P353 图5-23
DNA样品        酶切         电泳           变性         转膜          固定         杂交           洗涤              放射自显影
变性（NaOH 0.5mol/L）
转膜（NC膜）
固定（80℃，4-6h）
杂交（高盐浓度，68℃，几小时）
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。
可用DNA或RNA探针。
2、 Northern Blotting
研究对象是mRNA
检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在，因而可以研究细胞内特定mRNA的产生，即特定基因的表达。
mRNA易形成局部二级结构，因此，总RNA或mRNA需在变性条件下电泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。
3、 Western Blotting
是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。
六、 DNA序列分析
（一） 化学裂解法（Maxam-Gilbert 法）
DNA一级结构测定原理：
利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。
一定浓度的特测片段
                       32P-GCTACGTA
特异性化学裂解
在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT
在G处：32p-GCTA
在C处：32P-G和 32P-GCTA
在T处：32P-GC和32P-GCTACG
        图

硫酸二甲酯特异切割：G
甲酸特异切割：G和A
肼在Nacl条件下切割：C
肼在无 Nacl条件下切割：T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯：   *ACTTC
甲酸：         *P
               *ACTTC
*ACTTCG 
*ACTTCGAC
                *ACTTCGACA
肼（有Nacl）：  *A
               *ACTT
               *ACTTCGA
肼（无Nacl）：  *A     
*AC    
*ACT
                *ACTT
*ACTTCGA
从下往上读：CTACGTA
末端G不能读出。
（二） 双脱氧终止法
英国   Sanger
     1955  确定牛胰岛素结构
     1958  获诺贝尔化学奖
     1980  设计出DNA测序法
     1980  再获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
         图

胰岛素的基因工程：A链21a.a   63个核苷酸
                  B链30a.a   90个核苷酸
（三） 序列分析仪
四色荧光基团标记的ddNTP
七、 DNA合成（合成探针、引物、基因）
1、 化学合成——DNA合成仪
DNA固相合成（亚磷酸三酯法）
合成方向：3’        5’端
5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，
碱基上氨基用苯甲酸保护
3’-OH用氨基磷酸化合物活化

P353  合成过程

保护： 5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH2
2、 DNA的酶合成——PCR
用DNA聚合酶I
必备条件：
①模板DNA（单链）
②引物
③DNA聚合酶
④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP 
⑤一定浓度的Mg2+
链合成方向：5  ’      3’端
新的DNA链合成，从引物DNA的3’-OH开始。
          图

链的增长反应是引物DNA的3’-OH，对脱氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子亲核进攻的结果。
化学合成：方向3’     5’，不需DNA模板，不用酶。
生物合成：方向5’     3’，需模板，引物，用酶。
第七章  激  素
第一节 概 论
重点：分泌（来源）、化学本质、作用机理、常见激素的功能。
一、 激素的概念
1、 激素
早期概念：由动物器官产生，通过血液到达靶器官，并产生特异激动效应的一类化合物。
现在概念：机体内一部分细胞产生，通过扩散、血液运送至另一部分细胞，并起代谢调节控制作用的一类微量化学信息分子。
广义概念：多细胞生物体内，协调不同细胞活动的化学信使。它使高等生物体的细胞、组织和器官，既分工又协作。
2、 分泌特点  《顾天爵》  P 314
（1）内分泌：内分泌细胞分泌激素，进入血液循环，转运至靶细胞，产生激动效应。
（2）旁分泌：部分细胞分泌激素，通过扩散，作用于邻近的细胞。
（3）自分泌：细胞分泌的激素对自身或同类细胞发挥作用。
（4）外激素：从体内分泌，排出体外，通过空气、水等传插，引起同种生物产生生理效应。
二、 激素分类（按化学本质分类）
P421~423   表8-1、8-2 
1、 含氮激素
含氮激素是一大类激素，包括蛋白质、肽、儿茶酚等水溶性大分子，不易通过细胞膜。通过与膜受体结合，诱导生成第二信使，将信号转导入细胞内。
胺类激素：    儿茶酚
a.a衍生物类激素：    甲状腺素
肽类激素：    抗利尿素
蛋白质类激素：    生长素、胰岛素、 促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）
垂体和下丘脑分泌的激素都是含氮激素（蛋白类、多肽类），甲状腺、甲状旁腺、肾上腺髓质、胰岛、肠黏膜、胃黏膜、等分泌的激素也是含氮激素。
2、 甾体激素（甾醇类激素）
肾上腺皮质、性腺、胎盘等分泌的激素都属此类。类固醇激素、甲状腺素等小分子脂溶性激素，可通过细胞膜进入细胞内，与细胞质内受体结合，然后进入细胞核发挥作用。
3、 脂肪族激素（脂肪酸衍生物激素）
主要是前列腺素PG，目前已知有几十种此类激素。
三、 激素作用的特点
1. 信号传递作用
2. 级联放大作用
极微量的激素，就可产生强烈的生理效应。在体内的水平一般在10-7-10-12mol/L（10-9—10-15 mol/L）
3. 相对特异性
激素与受体结合是专一的，受体在靶细胞膜表面或细胞内部，甾醇类激素可穿过细胞膜。
4. 作用的时效性
有些激素到达靶细胞后，几秒钟内起作用；另一些需几小时至几天才达到最大生理效应，在血液中寿命较短。
5. 激素间的相互作用 
几种激素之间有时相互协同，有时相互抑制。
第二节 激素的分泌与控制
一、 下丘脑分泌的激素（多肽，共有十种）
丘脑下部的神经细胞能分泌多种肽类激素，它们经垂体门静脉系统，到达腺垂体，促进或抑制腺垂体某些激素的释放
下丘脑激素直接控制垂体激素的分泌，通过垂体间接控制其它外周内分泌腺的分泌。
下丘脑激素由下丘脑的某些神经细胞分泌，而这些细胞的分泌功能则由神经作用通过神经介质来调节。
P421 
1、 促甲状腺激素释放因子（TRF）
由焦谷—组—脯组成的三肽激素。
功能：促进促甲状腺激素（TSH）的分泌。
2、 促黄体生成激素释放因子（LRF）
卵巢分泌的雌性激素（孕酮、雌二醇）对LRF的分泌有负反馈抑制作用。
3、 促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）
促进垂体前叶释放促肾上腺皮质激素（ACTH）
4、 生长激素释放抑制因子（GRIF）
能抑制生长激素的分泌，且抑制胰高血糖素分泌，促进胰岛素分泌。
二、 垂体分泌的激素（蛋白质） 
（一） 垂体前叶激素
1、 生长激素（GH）
是蛋白质，动物的生长激素分子量20000-50000不等，人的GH分子量 21500 ，191个a.a
功能：刺激骨骼生长，促进粘多糖及胶原的合成，影响蛋白质、糖、脂代谢，最终影响体重的增长。
2、 促甲状腺激素（TSH）
功能：促进甲状腺的发育及分泌。
促甲状腺激素的分泌受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放因子的促进。
3、 促黄体生成激素（LH）
功能：促进卵泡发育成黄体，促进胆甾醇转变成孕酮并分泌孕酮，阻止排卵，抑制动情。
4、 促卵泡激素（FSH）
功能：促使卵巢（精巢）发育，促进卵泡（或精子）的生成和释放。
5、 催乳激素（LTH）
功能，刺激乳腺分泌乳汁，刺激并维持黄体分泌孕酮。
LTH大大促进乳腺中RNA及蛋白质的合成，还使乳腺中许多参与糖代谢、脂代谢的酶活力增大。
6、 促肾上腺皮质激素（ACTH）
功能：促进体内储存的胆甾醇在肾上腺皮质中转化成肾上腺皮质酮，并刺激肾上腺分泌激素。
（二） 垂体后叶激素（由下丘脑合成，贮存在神经垂体中）
1、 催产素  
结构：P115  图3-32 
功能：使多种平滑肌收缩（特别是子宫收缩）。孕酮可抑制催产素的作用。
2、 加压素（抗利尿素）
功能：使小动脉收缩，增高血压，并可减少排尿，调节水代谢。
三、 腺体分泌的激素（外周内分泌腺）
P422—423

1. 甲状腺、甲状旁腺
2. 肾上腺（髓质）
3. 胰岛
4. 肾上腺（皮质）  糖皮质、盐皮质

四、 激素分泌的调节控制
P463  
1、 上级对下一级的调节
          大脑皮层

             丘脑下部
                    促激素释放（抑制）因子
             垂 体
                    促激素
             外周腺体
                    激素
             外围激素
     
             最终靶细胞
2、 负反馈作用
是机体对激素的产生和分泌进行调节的基本方式之一。能维持激素浓度的相对稳定，保持对激素效应的控制。
外围激素对下丘脑或垂体的调节称长负反馈，促激素对下丘脑的调节称短负调节。
下丘脑本身产生的激素对下丘脑的调节称超短负反馈。
3、 酶的分步剪切调节
有的激素经几个酶作用，在不同水平上被分步剪切，逐步被激活，激素的效应也就因酶的分步剪切而得到调节。
4、 多元调节
激素通远它们之间的相互制约、相互依赖而受到调控。
第三节 激素作用机理
一、 受体及特点   胞外受体、胞内受体
1、 受体：
细胞中能识别配体（神经递质、激素、细胞因子）并与其特异结合，引起各种生物效应的分子，均称为受体。
受体的化学本质是蛋白质，在细胞表面的受体大多为糖蛋白。
激素、细胞因子和神经递质的浓度都很低，激素在10-9—10-15mol/L（10-7—10-12 mol/L）之间，而血液循环中具有相似结构的化合物（蛋白、氨基酸、固醇等）的浓度为10-3—10-5mol/L之间。
正是依赖高亲和力和特异性的受体，激素才能与特异靶细胞结合并发挥作用，而受体则成为细胞接受及传递信息的装置，在细胞间信息传递过程中起重要作用。
2、 激素与受体结合的特点（细胞因子）
①高亲和力      HR=H+R
激素（H）与受体（R）的亲和力可用其解离常数Kd 表示
                       

Kd在10-9—10-11 mol/L
Kd越小，表明亲和力越高，激素的浓度很低也能与受体结合，引起生物效应。
②高特异性
此特性由受体的结合域与配体的结构部位，以及受体与配体的构象决定。只有有相应受体的靶细胞，才对激素起反应。没有相应受体的细胞，同样也接触激素，但不会引起反应。细胞因子、神经递质与其受体产关系与此相似。
内分泌腺细胞          血液        靶细胞
     图

③激素与受体结合是非共价的、可逆的
当激素与受体分离后，激素的信使作用即中止。

                      =常数  当[H]↓时则[HR]↓

④细胞的受体数目很大
一般有数百至数千个，甚至数万个。激素生物效应的强弱通常与同受体结合激素的量成正比，但是当激素浓度升高至一定浓度时，由于受体的数目有限，激素与受体的结合曲线呈饱和状态。受体饱和以后，激素的生物效应就不再随激素浓度升高而增强。
      图

3、 受体的结构与功能
激素与受体结合，是信息传递至细胞的第一步。随后，由受体构象的变化引起一系列信息传递过程，因此，所有受体包含二个功能部分。一个是与配体结合的结合域，结合域的构象或活性基团，决定其结合配体的特异性，另一个是功能部分，参与转导信息。
①受体—离子通道型
受体本身构成离子通道，当其结合域与配体（激素）结合后，受体变构，使通道开放或关闭，引起或切断离子流动，从而传递信号。
例如：乙酰胆碱受体
神经元的乙酰胆碱受体，由5个亚基在细胞膜内呈五边形排列，围成离子通道壁。当它与乙酰胆碱结合时，膜通道开放，膜外阳离子（Na+为主）内流，引起突触后膜电位变化。
②受体—G蛋白—效应蛋白型
许多信息物质与细胞膜受体结合后，受体变构，激活相应的效应蛋白（如酶或其它功能蛋白）。酶被激活后，可催化生成一些小分子化学物质，后者进入胞液内，引起细胞产生相应的生物效应，称为第二信使。
在真核细胞中，鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白（简称G蛋白）在联系细胞膜受体与效应蛋白质中起重要作用。
③受体—酪氨酸蛋白激酶型
胰岛素及一些细胞生长因子的受体，本身具有酪氨酸蛋白激酶活性。这些受体是跨膜糖蛋白，胞外部分构成结合域以结合配体，中间有20多个疏水aa，构成跨膜区，胞内有较多可以被磷酸化的酪氨酸残基。
④受体—转录因子型
类固醇激素及甲状腺激素的受体位于细胞内，它们进入细胞内与细胞内受体结合后，生成活化的激素—受体复合物，该复合物转移入核内，与所调控基因的特定部位结合，然后启动转录。
二、 激素的作用机理
（一） cAMP—蛋白激酶A途径
反应快，几分钟。通过环核苷酸而起作用，大部分含氮激素都以这种方式起作用。
要点：
P424  图8-1  激素通过cAMP起作用的示意图

含氮激素作为第一信使与靶细胞膜上的特异受体结合，引发已结合在受体上的G蛋白生成Gs蛋白—GTP，Gs蛋白活化膜上的腺苷酸环化酶，活化的腺苷酸环化酶催化ATP转化成cAMP。cAMP自由扩散到整个细胞，对代谢酶起活化或抑制作用，间接控制细胞的代谢过程。cAMP激活依赖cAMP的蛋白激酶（蛋白激酶A、PKA），蛋白激酶A催化一些蛋白质的Ser、Thr的羟基磷酸化，从而改变这些酶的活性，调节代谢。
激素被称为第一信使。
cAMP被称为第二信使。
对一些关键酶的磷酸化是调节代谢途径的快速方式，蛋白激酶A能磷酸化的酶很多。
被磷酸化的酶      活性改变        代谢调节
磷酸化酶b激酶    激活     糖原分解，抑制糖原合成。
糖原合成酶        抑制           抑制糖原合成
丙酮酸激酶        抑制           抑制糖酵解

（二） IP3、Ca2+—钙调蛋白激酶途径
此途径的第二信使是：三磷酸肌醇IP3及Ca2+。
要点：激素（儿茶酚胺、血管舒张素Ⅱ、抗利尿素、5-羟色胺等）与细胞膜上相应受体结合，激活G蛋白，通过G蛋白介导，激活磷脂酶C（PLC，磷酸肌醇酶）。后者可将磷脂酰肌醇—4.5—二磷酸（PIP2）水解成二脂酰甘油DAG及IP3，这二者都是第二信使。
DAG可激活蛋白激酶C，活化的蛋白激酶C可将多种靶蛋白中的Ser、Thr残基磷酸化，调节酶活性。
IP3是小分子化合物，进入细胞液内，从而将信息传导至细胞内。在内质网膜表面有IP3受体，IP3受体是四聚体，其亚基的羧基部分构成钙通道。IP3与IP3受结合后，变构，钙通道打开，贮于内质网的Ca2+释放入细胞质内，使胞质Ca2+浓度升高。Ca2+升高可激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaM激酶）。CaM有4个结合Ca2+位点，当结合Ca2+后变构，一些依赖Ca2+/CaM的蛋白激酶就被激活，从而可使许多蛋白质的Ser、Thr残基磷酸化，使酶激活或失活。Ca2+/CaM复合物也可以直接地与靶酶起作用。

可被CaM 激酶磷酸化的酶有： 
糖原合成酶、磷酸化酶激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶等几十种。★ 钙调蛋白 EF手
P451  图8-20  EF手构象

螺旋区—泡区一螺旋区结构的钙传感器家族成员之一。

钙离子与许多生理活动有关，是许多信号传导途径中的细胞内信使，与细胞收缩、胞吐、胞饮、糖元代谢、神经递质释放、染色体运动、细胞死亡等都有密切关系。

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