（二） DNA二级结构的多型性
P339  表5-6 A-、B-、Z-DNA的比较
1、 B—DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA
右手双股螺旋
每圈螺旋10.4个碱基对
每对
螺旋扭角36°
螺距：3.32nm
碱基倾角：1°
2、 A-DNA
在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。
A-DNA也是右手双螺旋，外形粗短。
RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。
3、 Z-DNA
左手螺旋的DNA。
天然B-DNA的局部区域可以形成Z0-DNA。
4、 DNA三股螺旋
在多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，序列中有较长的镜像重复时，可形成局部三股螺旋，称H-DNA。
镜像重复：

TAT配对
C+GC酸对
DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始或调节位点，第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。
四、 环状DNA
生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：
某些病毒DNA
某些噬菌体DNA
某些细菌染色体DNA
细菌质粒DNA
真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA
1、 环形DNA的不同构象
P340 图5-8  松驰环、解链环、负超螺旋
（1）、 松弛环形DNA
线形DNA直接环化
（2）、 解链环形DNA
线形DNA拧松后再环化
（3）、 正超螺旋与负超螺旋DNA
线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。
绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。
如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。
对于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初级螺旋的碱基对数小于10.4，则其二级结构处于紧缠状态，是正超螺旋。
如果每圈初级螺旋的碱基对数大于10.4，则其二级结构处于松缠状态，是负超螺旋。

2、 环形DNA的拓扑学特性
以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。

P340  图25-8  松驰环、解链环、负超螺旋

①连环数（L）
DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。
松驰环：L=25
解链环：L=23
超螺旋：L=23
②缠绕数（T）
DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示
松驰环T=25
解链环T=23
超螺旋T=25
③超螺旋周数（扭曲数W）
松驰环W=0
解链环W=0
超螺旋W= -2
L=T+W
④比连环差（λ）
表示DNA的超螺旋程度
λ=（L—L0）/L0
L0是指松驰环形DNA的L值
天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03~-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。
负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等需要将两条链分开才能进行的反应。
3、 拓扑异构酶
此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。
①拓扑异构酶酶I（拧紧）
能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。
②拓扑异构酶酶II（拧松）
能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。
五、 染色体的结构
1、 大肠杆菌染色体
大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。
大肠杆菌DNA结合蛋白：                             每个细胞
H                    两个28KD的相同亚基         30000个二聚体
HU                   两个各9KD的不同亚基        40000个二体聚体
HLP1                 17KD的亚基                  20000个单体
P                     3KD的亚基                  未知

这些DNA结合蛋白，使4.2×106bp的E.coli染色体DNA压缩成为一个手脚架形结构，结构中心是多种DNA结合蛋白，DNA双螺旋分子有许多位点与这些蛋白结合，形成约100个小区，每个小区的DNA都是负超螺旋，一个小区的DNA有两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。
         图

用极微量的DNA酶I处理时，只能使少量小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。
2、 真核生物染色体
主要由组蛋白和DNA组成。
组蛋白是富含碱性a.a(Lys、Arg)的碱性蛋白质，根据Lys/Arg比值不同，可分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均为单链蛋白质，分子量11000-21000。
H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成组蛋白八聚体。
146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。
核小体间DNA长度15-100bp（一般60bp）其上结合有H1
         图

2H2A、2H2B、2H3、2H4组蛋白八聚体   146bpDNA     核小体 
  串联      染色质     折叠      染色体

DNA（直径2nm）
                      盘绕组蛋白八聚体上，结合H1，压缩比1/7 
核小体（一级结构）
                      螺旋化，压缩比1/6
螺线管（二级结构）
                      再螺旋化，压缩比1/40
超螺线管（三级结构）
                      折叠，压缩比1/5
染色单体（四级结构）
               总压缩比：1/8400~1/10000
六、 DNA的生物学功能
首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。
P342  1~4   Avery的肺炎双球菌转化实验
第三节   RNA的结构
一、 RNA的一级结构
RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通过3/、5/磷酸二酯键形成的线形多聚体。

P343  图5-10  RNA基本结构

① 组成RNA的戊糖是核糖
② 碱基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中还有一些稀有碱基。
③ 天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。双螺旋区一般占RNA分子的50%左右。
二、 RNA的类型
细胞中的RNA，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型。
核糖体RNA    rRNA   
转运  RNA    tRNA
信使  RNA   mRNA    
此外，真核生物细胞中有少量核内小RNA（small nuclear RNA snRNA）

P344  表5-7  大肠杆菌中的RNA

沉降系数：单位离心场中的沉降速度，以S为单位，即10-13秒。
如23S rRNA ，单位离心场中沉降  23×10-13秒
   5S rRNA ，单位离心场中沉降   5×10-13秒
三、 tRNA的结构 
tRNA约占全部RNA的15%
主要功能：在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸。
已知一级结构的tRNA有160种，每种tRNA可运载一种特定的a.a，一种a.a可由一种或多种tRNA运载。
结构特点
①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系数4S左右
②碱基组成中有较多稀有碱基
      图
③3’末端为…CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。
④5’末端大多为pG…或pC…
⑤二级结构是三叶草形

P345  图5-12  tRNA的二级结构（三叶草模型）

1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：
认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。
四、 mRNA的结构
mRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码，细胞内 mRNA种类很多，大小不一，每种含量极低。
从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。
顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。
1、 真核mRNA
（1）、 3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。 
PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一。
原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。
polyA功能：
PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。
PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。
（2）、 5’-帽子帽子
5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键。
P346   帽子结构

帽子的功能：
可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。
可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。
2、 原核mRNA（多顺反子）
原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。
举列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。

          图MS2病mRNA

5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。
原核mRNA代谢很快，半寿期几秒至十几分钟。
五、 rRNA的结构
rRNA占总RNA的80%左右。
功能：rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。
大肠杆菌中有三类rRNA（原核）
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA
真核细胞有四类rRNA
5S rRNA
5.8S rRNA
18S rRNA
28S rRNA

          图  原核核糖体（rRNA 部分）


          图   真核核糖体（rRNA部分）

P346  图5-14   大肠杆菌  5S rRNA  结构
第四节   核酸的性质
一、 解离性质
多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。
磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。
DNA等电点  4—4.5
RNA 等电点 2—2.5
RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。
二、 水解性质
1、 碱水解
室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
         图

在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。
DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。
DNA稳定 ，遗传信息。
RNA是DNA的信使，完成任务后降解。
2、 酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶
RNA水解酶  RNase
DNA水解酶  DNase
核酸外一切酶
核酸内切酶  最重要的：限制性核酸内切酶
三、 光吸收性
碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　　　　λmax=260nm
1、 鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。
2、 含量计算
1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA
                  或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）
                  或：20ug/mL核苷酸
3、 增色效应与减色效应
P347  图5-15  DNA的紫外吸收光谱

增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大
减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
四、 沉降特性（DNA）
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。

      P348 图5—16  Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA

相对沉降常数
线型双螺旋分子                1.00
松驰双链闭环                  1.14
切刻双链环                    1.14
单链环                        1.14
线型单链                      1.30
正超或负超螺旋双链环状        1.41
坍缩                          3.0

五、 变性、复性及杂交
变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。
1、 变性
（1）、 变性：
核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。
DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。
P350  图5-18变性过程

          热变性
因素      酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）
           变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）  
             260nm吸收值升高。
   变性后   粘度降低，浮力密度升高。
               二级结构改变，部分失活。   
（2）、 熔解温度（Tm）或称熔点：
DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。
浓度50ug/mL时，双链DNA  A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。
（3）、 影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性   均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围
内。
②G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，则Tm越高，测定Tm，可推知G-C含量。。
G-C%=（Tm-69.3）×2.44

P351图5-19     图5-20   Tm值与GC含量的关系
③介质中离子强度
其它条件不变，离子强度高，Tm高。
P351    图5-21
2、 复性
变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。
变性DNA在缓慢冷却时（快速冷却可防止复性），可以复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。
复性速度可用Co·t衡量。
Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。

P352  图5-22，不同DNA的复性时间。

A．1个核苷酸对（A.U）
图上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L
若浓度为Co=1.0m mol/L
则复性50%所需时间t=0.004秒
若要全部复性，Cot=10-4  t=0.1秒
B．E.coli  4.2×106碱基对
图上查出Cot1/2=10 mol.s/L
若浓度Co=1.0 umol/L则复性50%所需时间t=107秒，约115天。复性100%Cot=500 mol.s/L
t=5×108秒，5758天。
对于E.coli ，4.2×106bp，浓度达到umol/L级时，浓度已很高。  
复性机制：10-20bp成、拉链
3、 杂交（DNA—DNA、 DNA—RNA）
将不同来源的DNA混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。

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