5、 活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。如溶菌酶Asp52带负电荷，可以稳定过渡态的正离子。
酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。
三、 某些酶的活性中心及其作用机理
（一） 酶的活性中心
1、 活性中心的概念
对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团，它们在一级结构上相距可能很远，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。
对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。
一般认为，活性中心有两个功能部位：底物结合部位，催化部位
活性中心外的部位为活性中心的形成提供了结构基础 。
2、 活性中心的氨基酸残基
有七种a.a在酶活性中心出现的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的a.a残基往往分散在相互较远的a.a顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，如α-胰凝乳蛋白酶活性中心的几个a.a残基，分别位于B、C两个肽链上，靠分子空间结构的形成，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
酶分子a.a残基分类
（1）接触残基
它们与底物接触，参与底物的化学转变，此类a.a残基的一个或几个原子与底物分子中一个或几个原子的距离都在一个键距离之内（1.5-2A）。
它们的侧链起与底物结合作用的称为结合基团，起催化作用的称为催化基团。
（2）辅助残基
它不与底物接触，而是在使酶与底物结合及协助接触残基发挥作用方面起作用。
上述两类残基构成酶活性中心。
（3）结构残基
在维持酶分子正常三维构象方面起重要作用，它们与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基
上述三类残基统称酶的必需基团，若被其它a.a取代，往往造成酶失活。
（4）非贡献残基（非必需基团）
它们对酶活性的显示不起作用，可由其它a.a代替，且在酶分子中占很大比例。
它们可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。
                                            结合底物作用（结合残基）
                               接触残基
                     活性中心               催化作用（催化基团）
           必需基团            辅助残基
                     活性中心外（结构残基）
酶蛋白
           非必需基团
3、 活性中心区域的一级结构
由于一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理极其相似，可把它们归为一族。
蛋白水解酶就有几个族：
（1）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）
（2）锌蛋白酶（羧肽酶等）
（3）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶等）
（4）羧基蛋白酶（胃蛋白酶等）
在同一族酶中，活性中心一级结构的a.a顺序极相似。
酶                                 a.a顺序
胰蛋白酶（牛）         Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys
胰凝乳蛋白酶（牛）     Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn
弹性蛋白酶（猪）       Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn
凝血酶（牛）         …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro
这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽：
         …Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro…
u 同源的趋异进化
来自胰脏的胰凝乳蛋白酶（Phe、 Tyr、 Trp、）、胰蛋白酶（Lys、Arg ）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的a.a顺序相同，且分子一级结构中有40%a.a顺序相同，三维结构也相同，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同。
这种来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。
u 异源的趋同进化
来自枯草杆菌的Ser蛋白酶的结构与上述三种酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a顺序也不同（-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser）。
电荷中继网的位置也不同：

电荷中继网的位置也不同：
Asp102-His57-Ser195（胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶）
Asp32-His64-Ser221（枯草杆菌蛋白酶）
这表明枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶等三个酶来源不同，但它们的电荷中继网相同，功能相同，这种情况称异源的趋同进化。
4、 判断和研究活性中心的主要方法
（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法
（二） 酶作用机理举例
1、 胰凝乳蛋白酶的作用机理：
（1）、 专一性
         图

该酶需要底物有一个疏水基团结合于酶上的疏水部位，这个结合起定位作用，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
（2）、 催化机理
① 活性中心：Ser195—His57—Asp102，三者构成一个氢键体系，His57的咪唑基是Ser195的羟基和Asp102的羧基之间的桥梁，这个氢键体系称为电荷中继网（harge  relay  network）。通过电荷中继网，进行酸碱催化及共价催化。Ser195由于His57和Asp102的影响而成为很强的亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。

ＰP285 图4-27，P287 图4-30 胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网


② 胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程  

      P288  图4—31胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程

第一阶段  酰化
Ser195--OH 中的氧攻击肽键的羰基碳，形成四联体过渡态（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑），敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段  脱酰
电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，结果底物中的酸成分从Ser195上释放。

除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser电荷中继网的还有胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶等，但它们的底物结合部位不同，底物专一性也不同。

P288  图4-32三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部胰凝乳蛋白酶          胰蛋白酶          弹性蛋白酶
可供芳香环及大     可供带电荷的    只能让Ala等小分子
的非极性侧链伸入    Lys.、Arg进入        进入
第五节 多酶体系与酶活性的调节控制
一、 多酶体系
（一） 多酶体系及其分类
细胞中的许多酶，常常在一个连续的反应链中起作用，前一个反应的产物是后一个反应的底物。
多酶体系：multienzyme system在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。
可分为三种类型：可溶性的（分散性的），结构化的（多酶复合体），在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）。
     P297 图4—42（分散性的多酶体系）  图4-43 （多酶复合体）
（二） 多酶体系的自我调节
（1）大部分具有自我调节能力的多酶体系，第一步反应就是限速步骤，它控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活
催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有时则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活

P299   图4-45反馈抑制与底物激活

正调节物：一般是别构酶的底物，可以激活别构酶。
负调节物：可以抑制别构酶，一般是代谢序列的最终产物。
通过多酶体系的自我调节（反馈抑制和底物激活），可使代谢过程得以协调地、有条不紊地合理进行。
下面讨论具体到每个酶是怎样调节的
二、 酶活性的调节控制和调节酶
调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价调节酶。
（一） 别构效应的调控
别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。
（1）、 别构酶的结构特点和性质
（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基
（2） 具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
（3） 多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
（4） 别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。
（2）、 别构酶的动力学曲线
① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线
P303  图4-46   4-47

这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1=3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。

当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。
② 同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线
P304图4-48
负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感
（3）、 别构酶调节活性的机理
① 序变模型：
酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。
② 齐变模型：
（4）、 别构酶的鉴定
① S型曲线是必要但不充分条件
② 脱敏作用
③ [S]0.9／[S]0.1
Rs=81 米氏酶
Rs＜81 正协同 
Rs＞81 负协同
④ Hill系数法
（二） 可逆共价修饰的调控（共价调节酶）
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶   
P313  图4-57

信号的级联放大：
1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a
1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G
共价调节酶的两种常见类型
①磷酸化         去磷酸化     -OH  ATP
②腺苷酰化        脱腺苷酰化  腺苷酰基由ATP提供
（三） 酶原的激活
具有不可逆性。属于此类的有消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
（1）、 胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）

P314    图4-58
（2）、 胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活
                 肠激酶
              胰蛋白酶原       胰蛋白酶

胰凝乳蛋白酶原                弹性蛋白酶原
                       胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶                  弹性蛋白酶 
                羧肽酶原        羧肽酶
（四） 专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制
钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特异的酶活性
第六节 酶与抗体——抗体酶 abzyme(antibody enzyme)
参阅 P293
又称催化性抗体（catalytic antibody），是一种具有催化功能的抗体分子。
过渡态理论：酶与底物不是在基态，而是在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
而抗体与抗原是基态结合。

第七节 同工酶、诱导酶
1、 同工酶
能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构不同的一组酶，存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。
哺乳动物乳酸脱氢酶有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+  LDH   CH3COCOO-+NADH+H+ 
均由4个亚基组成
HHHH     在心肌中占优势
HHHM  
HHMM
HMMM
MMMM   在骨骼肌中占优势
2、 诱导酶
酶可相对地区分为结构酶和诱导酶。
结构酶：指正常细胞内存在的酶，它的含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
如：大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
E.coli在含Glc的培养基中
E.coli在只含乳糖的培养基中：Glc-β(1→4)Gal苷
第八节 酶工程

计划：8学时

第六章 核 酸
核酸是遗传物质
1868年瑞士Miesher.从脓细胞的细胞核中分离出可溶于碱而不溶于稀酸的酸性物质。
间接证据：同一种生物的不同种类的不同生长期的细胞，DNA含量基本恒定。
直接证据：T2噬菌体DNA感染E.coli
用35S标记噬菌体蛋白质，感染E.coli，又用32P标记噬菌体核酸，感染E.coli
DNA、RNA的分布（DNA在核内，RNA在核外）。
第一节 核酸的化学组成
核酸是一种线形多聚核苷酸，基本组成单位是核苷酸。
结构层次：                 核  酸
                           核苷酸

                  磷酸                      核苷
      
                                       戊糖     碱基
组成核酸的戊糖有两种：：D-核糖和D-2-脱氧核糖，据此，可以将核酸分为两种：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）
           P330 表5-1  两类核酸的基本化学组成
一、 碱基
1. 嘌呤碱：        腺嘌呤        鸟嘌呤
2. 嘧啶碱：     胞嘧啶     尿嘧啶     胸腺嘧啶

P331 结构式

3. 修饰碱基
植物中有大量5-甲基胞嘧啶。
E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。
稀有碱基：100余种，多数是甲基化的产物。
DNA由A、G、C、T碱基构成。
RNA由A、G、C、U碱基构成。
二、 核苷
核苷由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。
核酸中的核苷均为β-型核苷
           P332  结构式  腺嘌呤核苷    胞嘧啶脱氧核苷

DNA 的戊糖是：脱氧核糖
RNA 的戊糖是：核糖
三、 核苷酸
核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化，生成核苷酸。
1、 构成DNA、RNA的核苷酸
P333表5-3
2、 细胞内游离核苷酸及其衍生物
①核苷5’-多磷酸化合物
ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG
在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。
②环核苷酸
cAMP（3’，5’-cAMP） cGMP（3’，5’-cGMP）
它们作为质膜的激素的第二信使起作用，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。
③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物
ppGpp    pppGpp    ppApp
④核苷酸衍生物
HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。
GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。
第二节 DNA的结构
一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。
二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。
三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。
一、 DNA的一级结构
DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3/、5/-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。3/、5/-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构 。

   P334      图  5-1

书写方法：5/ → 3/：
5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游离的）
在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序。
遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的精确的排列顺序中。
二、 DNA的二级结构
1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射数据提出了DNA的双螺旋结构模型。
1、 Watson-Crick双螺旋结构建立的根据
①Chargaff 规律   1950年
a. 所有DNA中，A=T，G=C  且A+G=C+T。
P334表5—4。
b. DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物的DNA皆有自己独特的碱基组成。
c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。
d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。
② DNA的Na盐纤维和 DNA晶体的X光衍射分析。
相对湿度92%，DNA钠盐结晶，B—DNA。
相对湿度75%，DNA钠盐结晶，A—DNA。
                             Z—DNA。
生物体内DNA均为B—DNA。
Franklin 的工作
2、 Watson-Crick双螺旋结构模型
P335 图5—2

a.两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’
b.嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3/、5/-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。
                      宽1.2 nm          宽0.6nm
               大沟              小沟 
                      深0.85nm         深0.75nm
c.螺旋平均直径2nm  
每圈螺旋含10个核苷酸
碱基堆积距离：0.34nm
螺距：3.4nm
d.两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。碱基平面垂直于螺旋轴。A=T、G=C
    P336    图5—4

碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。
3、 稳定双螺旋结构的因素
①碱基堆积力（主要因素） 形成疏水环境。
②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。
③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。
④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。
三、 DNA二级结构的不均一性和多型性
（一） DNA二级结构的不均一性
1、 反向重复序列（回文序列）
DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同，即对称轴一侧的片段旋转180°后，与另一侧片段对称重复。
较长的回文结构，在某些因素作用下，可形成茎环式的十字结构和发夹结构。功能还不完全清楚，但转录的终止作用与回文结构有关。
较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。
2、 富含A T的序列
高等生物中，A+T与C+G的含量差不多相等，但在它们的染色体的某一区域，A T含量可能很高。
在很多有重要调节功能（不是蛋白质编码区）的DNA区段都富含A T碱基对。特别是在复制起点和启动的Pribnow框的DNA区中，富含A T对。这对于复制和转录的起始十分重要，因为G C对有三个氢键，而A T对只有两个氢键，此处双键易解开。

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