（三） 可逆抑制作用的动力学

用书上P263-266的方法可推出三种抑制方程。
1、 竞争性抑制： 
动力学方程：


竞争性抑制曲线:

P263  图4-12竞争性抑制曲线

竞争性抑制作用小结：
（1） Vmax不变，Km变大。要达到同一个给定的Vmax分数，必须要有比无抑制剂时大得多的底物浓度。
（2） 竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]、[S]、Km和Ki
A. [I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。
B. [S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加）。
C. Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大，Ki越大，抑制作用越小。
D. [I]=Ki时，所作双倒数图直线的斜率加倍。
E. 在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。
2、 非竞争性抑制
动力学方程：


相对速度：


抑制分数：


非竞争抑制曲线：

P265  图4-13

非竞争性抑制剂可使酶促反应的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki），而对Km无影响。它对酶促反应的抑制程度决定于[I]和Ki ，与酶的Km和[S]无关。
3、 反竞争性抑制
动力学方程：


相对速度：

抑制分数： 


P265   图4-14  反竞争抑制曲线

在反竞争性抑制作用下，Km及Vmax都变小，且Km’
P266  表4-7 小结：   三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值
九、 有机介质中的酶促反应（只是一部分酶）
传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。
其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。
优点：     ①利于疏水性底物的反应。
            ②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。
            ③能催化在水中不能进行的反应。
            ④可改变反应平衡移动方向。
            ⑤可控制底物专一性。
            ⑥防止由水引起的副反应。
            ⑦可扩大pH值的适应性等等。
1、 有机介质中酶促反应的条件
（1）、 必需水（结合水）
酶催化活性所必需的构象，是由水分子直接或间接地通过氢键等非共价相互作用来维持的，因此只有与酶分子紧密结合的单层水分子，对酶的催化活性才是至关重要的。
这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。
酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关，只要必需水不丢失，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍然保持其催化活性。
因此，可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。
一个干燥的酶水合：             吸附水量：
酶分子表面电荷基团：          0-0.07g/g  (水/酶)
酶分子表面极性基团：          0.07-0.25g/g
弱极性、非极性基团：          0.25-0.28g/g
表面完全水化，被一层水分子包围。
酶的必需水含量因酶而异。
脂肪酶：几个水分子/每个酶分子
胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子
乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子
（2）、 对酶的要求
具有对抗有机介质变性的经能力。
（3）、 合适的溶剂及反应体系
（4）、 合适的pH
保证有机介质中酶的微环境具有最适pH值。酶应从具有最适pH值的缓冲液中冻干或沉淀出来。
2、 有机介质对酶性质的影响
（1）、 稳定性
大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。
a. 热稳定性提高
例如：猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍
b. 储存稳定性提高
胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。
（2）、 活性  
有两类影响   升高活性
                   降低活性
酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。
（3）、 专一性
某些有机溶剂会使某些酶的专一性发生变化，如脂肪酶在有机介质中有合成肽键的功能。星号活力（第二活力）。
（4）、 反应平衡
有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。
例如：水解酶类（蛋白水解酶）
在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向，
如在含水量极低的有机介质中，平衡向含成方向偏移。

实例：（酶）       合成）产物       溶剂      合成收率  
枯草杆菌蛋白酶    核糖核酸酶      甘油90%     50%
无色杆菌蛋白酶     胰岛素         乙醇30%     80%
凝血酶             人生长素       甘油80%     20%
（5）、 分子印迹和pH记忆
酶在冻干前可用配体作印迹。
竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性构象，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
pH记忆：
酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。
第四节 酶的作用机理
一、 专一性的机理
（一） 酶专一性类型
一般说来，一种分子能成为某种酶的底物，必须具备两个条件：
分子上有被酶作用的化学键。
分子上有一个或多个结合基团能与酶活性中心结合。

2、 诱导楔合模型
酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。

P271     图4—18

二、 高效性的机理
1、 邻近效应与定向效应
酶把底物分子（一种或两种）从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
两种效应对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高
甚至比溶液中高10万倍，提高反应速度。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用
举例：酚羟基和羧基环化成内酸
         图
3个CH3固定了-OH和-COOH的相对方位。
③酶使分子间反应转变成分子内反应
反应速度提高：107
         图
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
酶底复合物寿命比一般双分子相互碰撞的平均寿命长，前者10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了产物形成的机率。
2、 扭曲变形和构象变化的催化效应
酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。

P276  图4-20

环状反应物I水解开环，环扭曲能量大量释放，加速反应。
底物与酶蛋白接触，加速反应。
①酶从低活性形式转变为高活性形式
②底物扭曲、变形
③底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。
3、 共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。
①亲核共价催化
丝氨酸羟基、Cys的-SH、His的咪唑基。
举例：咪唑基催化对硝基苯乙酸酯水解。
      图

②亲电共价催化
     亲电基团攻击底物的富电子基团
例：Asp转氨酶催化Asp 转氨反应
         图
P278  表4-13  形成共价ES复合物的某些酶
4、 酸碱催化
酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
参与酸碱催化的基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。

P279 表4-14 酶分子中可作为广义酸碱的功能基团

影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度，咪唑基在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快

①酸催化酯、酰胺和肽的水解
        图

过程：共轭酸与＞C=0氧形成氢键，使＞C=0碳带更多正电荷，更易吸引H2O分子上的氧，降低＞C=0碳与H2O氧形成共价键的活化能；接着，共轭酸将H+转移给＞C=0氧，自己成为共轭碱，并从H2O分子吸引一个H+， 回复原状。
②碱催化酯、酰胺水解
      图

过程：共轭碱先与H2O中H形成氢键，使H2O中氧的电负性增强，更易对＞C=0碳进行亲核进攻，降低碳氧键生成的活化能。
5、 活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。如溶菌酶Asp52带负电荷，可以稳定过渡态的正离子。
酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。
三、 某些酶的活性中心及其作用机理
（一） 酶的活性中心

糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
            A链49 a.a
         B链259 a.a
（2）、 纤维蛋白原

P133   图3-44  纤维蛋白原的结构

α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸
在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。

P133   纤维肽A .B的结构

A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。

P134上

在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
2、 胰岛素原的激活
P134图3-45

胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
五、 多肽与蛋白质的人工合成
在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。

P139图3-46  多肽的固相合成

C端       N端。
挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合                  
第五节 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质
二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。
一、 肽链的构象
多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。
1、 肽链的二面角
P143图3-51、图3-52
多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。
环绕Cα—N键旋转的角度为Φ
环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ
多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2看，顺时针旋转Cα- C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
2、 多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。
因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ

P144表3-12      蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。

拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。

P145  拉氏构象图（Gly除外）

⑴实线封闭区域
一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域
是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。
⑶虚线外区域
是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。
总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。
二、 二级结构的基本类型
驱使蛋白质折叠的主要动力：
(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
1、 α螺旋
（1）、 α螺旋及其特征
在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋
回忆 P143图3-52

② 每圈螺旋：3.6个a.a残基，  高度：0.54nm 
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
④ 氨基酸残基侧链向外
⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。
      图
这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。

2.27螺旋（n=1）
310   螺旋（n=2，Φ= -49°, Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
         2.27     310      3.613      4.316
n=1     n=2     n=3      n=4
     α-螺旋   π-螺旋
（2）、 R侧链对α—螺旋的影响
R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α—螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。
（3）、 pH对α—螺旋的影响
多聚L-Glu和多聚L-Lys

P149  图3-57

（4）、 右手α-螺旋与左手α-螺旋
        图  P148
右手螺旋比左手螺旋稳定。
蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。
（5）、 α-螺旋结构的旋光性
由于α-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不对称性，（2） 构象本身的不对称性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α—螺旋的相对含量，也可用于研究影响α—螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。
α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。
（6）、 α-螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性
一旦形成一圈α-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速。
2、 β-折叠
P149  图3—58    P150  图3—59

两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同
平行式：φ=-119°    Ψ=+113°
反平行式：φ=-139°    Ψ=+135°
从能量上看，反平β-折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。
在纤维状蛋白质中β-折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。
在纤维状蛋白质的β-折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β-折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。
3、 β-转角（β-turn）
β-转角也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pin structure）
β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。
目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
4、 无规卷曲  
没有规律的多肽链主链骨架构象。
球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。
α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。
三、 超二级结构
由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
1、 αα结构（复绕α-螺旋）
由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。
p153 图3-61  A

存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。
2、 βxβ结构
两段平行式的β-链（或单股的β-折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。
①βcβ
         x为无规卷曲
p153 图3-61  B

②βαβ
        x为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。
p153 图3-61  C
3、 β曲折（β-meander）
由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。

P153图3-61   D
4、 回形拓扑结构（希腊钥匙）
P153图3-61  E
5、 β-折叠桶
由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。
超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。
6、 α-螺旋-β转角-α-螺旋
两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。
λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构。在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为重要的地位。
四、 纤维状蛋白质
纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：长轴/短轴）大于10，轴比小于10是的球状蛋白质。
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和保护作用。
1、 角蛋白
源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为α-角蛋白和β角蛋白。
（1）、 α-角蛋白
P155 图3-63，P156  图3-64
  
主要由α-螺旋结构组成，三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微
结构稳定性由二硫键保证，α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象，烫发的化学机理Cys含量较高。
？a-角蛋白(a-Keratin)中有两种类型的多肽链：I型和II型。每一个I型多肽型和一个II型多肽链形成一个卷曲螺旋二聚体(Coiled coil dimmer)。一对卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋结构称原纤维(Protofilament，4股右手a-螺旋)，原纤维的亚基间以氢键和二硫键相连。4个原纤维形成微纤维，成百根微纤维形成大纤维，每一个头发细胸，也将纤维(fiber)含有数个大纤维，一根头发就是由无数的死细胞相互间以角蛋白相连组成的。？

（2）、 β-角蛋白
P157    图3-65

含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折叠结构为主。
丝心蛋白取片层结构，即反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
2、 胶原蛋白
3、 弹性蛋白
4、 肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白

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