|
教 程 说 明 | |
|

第一节 细胞生物学简史
从研究内容来看细胞生物学的发展可分为三个层次,即:显微水平、超微水平和分子水平。从时间纵轴来看细胞生物学的历史大致可以划分为四个主要的阶段:
第一阶段:从16世纪末—19世纪30年代,是细胞发现和细胞知识的积累阶段。
第二阶段:从19世纪30—20世纪中期,细胞学说形成后,主要进行细胞显微形态的研究。
第三阶段:从20世纪30年代—70年代,以细胞超微结构、核型、带型研究为主要内容。
第四阶段:从20世纪80年代分子克隆技术的成熟到当前,细胞生物学与分子生物学的结合愈来愈紧密,基因调控、信号转导、细胞分化和凋亡、肿瘤生物学等领域成为当前的主流研究内容。
一、显微镜的发明与细胞的发现
没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1. 1590 荷兰眼镜制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜,尽管其放大倍数不超过10倍,但具有划时代的意义。
2. 1665 英国人Robert Hook用自己设计与制造的显微镜(放大倍数为40-140倍,图1-1)观察了软木(栎树皮)的薄片,第一次描述了植物细胞的构造,并首次用拉丁文cella(小室)这个词来称呼他所看到的类似蜂巢的极小的封闭状小室(实际上只是观察到到纤维质的细胞壁)。
3. 1672,1682英国人Nehemaih Grew出版了两卷植物显微图谱,注意到了植物细胞中细胞壁与细胞质的区别。
4. 1680 荷兰人A. van Leeuwenhoek成为皇家学会会员,一生中制作了200多台显微镜和500多个镜头(图1-2)。他是第一个看到活细胞的人,观察过原生动物、人类精子、鲑鱼的红细胞、牙垢中的细菌等等。
5. 1752 英国望远镜商人J. Dollond 发明消色差显微镜。

图1-1 Robert Hook和他的显微镜

图1-2 A. van Leeuwenhoek的显微镜(图片来自http://www.arsmachina.com)
6. 1812 苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜,并改进了体视显微镜。
7. 1886 德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜,并改进了油浸物镜,至此普通光学显微镜技术基本成熟。
8. 1932 德国人M. Knoll和E. A. F. Ruska描述了一台最初的电子显微镜,1940年美国和德国制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。
9. 1932 荷兰籍德国人F. Zernike成功设计了相差显微镜(phasecontrast microscope) ,并因此获1953年诺贝尔物理奖。
10. 1981瑞士人G. Binnig和H. RoherI在BM苏黎世实验中心(Zurich Research Center)发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
二、细胞学说
在十九世纪以前许多学者的工作都着眼于细胞的显微结构方面,从事形态上的描述,而对各种有机体中出现细胞的意义一直没有作出理论的概括,直到19世纪30年代德国人施莱登Matthias Jacob Schleiden 、施旺Theodar Schwann提出:一切植物、动物都是由细胞组成的,细胞是一切动植物的基本单位。这一学说即“细胞学说(Cell Theory)”,在19世纪已有不少科学家的工作对细胞学说的创立做出了很大的贡献,如:
1. Jean-Baptiste de Lamark (1744~1829),获得性遗传理论的创始人,法国退伍陆军中尉,50岁成为巴黎动物学教授,1909年他认为只有具有细胞的机体,才有生命。“It has been recognized for a long time that the membranes which form the envelopes of the brain,of the nerves,of vessels,of all kinds of glands,of viscera,of muscles and their fibers,and even the skin of the body are in general the productions of cellular tissue。 But no one,so far as I know, has yet perceived that cellular tissue is the general matrix of all organization and that without this tissue no living body would be able to exist,nor could it have been formed。”
2. Charles Brisseau Milbel(1776~1854),法国植物学家,1802年认为植物的每一部分都有细胞存在,“the plant is wholly formed of a continuous cellular membranous tissue。Plants are made up of cells,all parts of which are in continuity and form one and the same membranous tissue。”。
3. Henri Dutrochet (1776~1847),法国生理学家,1824年进一步描述了细胞的原理,他认为 “All organic tissues are actually globular cells of exceeding smallness,which appear to be united only by simple adhesive forces; thus all tissues, all animal (and plant) organs, are actually only a cellular tissue variously modified。This uniformity of finer structure proves that organs actually differ among themselves merely in the nature of the substances contained in the vesicular cells of which they are composed” 。
4. Matthias Jacob Schleiden(1804~1881),德国植物学教授[1],1938年发表“植物发生论”(Beiträge zur Phytogenesis),认为无论怎样复杂的植物都有形形色色的细胞构成。他认识到了Brown发现细胞核的重要意义,这一点Brown本人并未做到,他试图重建细胞发育的过程,为此他聪明地选择了胚胎细胞作为他研究的起点,他还在细胞中发现了核仁。
5. Theodor Schwann(1810~1882),德国解剖学教授,一开始就研究Schleiden的细胞形成学说,他完全接受了这个学说,并把它扩展为所有生命现象的起源和基础的一般理论。他把Schleiden在植物中的发现应用到动物中去,并于1838年提出了“细胞学说”(Cell Theory)这个术语;1939年发表了“关于动植物结构和生长一致性的显微研究”(Mikroskopische Untersuchungen über die Übereinstimmung in der Struktur und dem Wachstum der Tiere und Pflanzen)。因此细胞学说的创立被认为归功于Schleiden和Sehwann两个人,而且年份也被定到1839年。
Schwann提出:
1) 有机体是由细胞构成的;
2) 细胞是构成有机体的基本单位。
1855 德国人R. Virchow 提出“一切细胞来源于细胞”(omnis cellula e cellula)的著名论断,进一步完善了细胞学说。
把细胞作为生命的一般单位,以及作为动植物界生命现象的共同基础的这种概念立即受到了普遍的接受。恩格斯将细胞学说誉为19世纪的三大发现之一。
三、细胞生物学的发展
19世纪后期显微技术的改进,生物固定技术(如:Fleming 1882,1884;Canoy 1886)和染色技术的出现极大的方便了人们对细胞显微结构的认识,各种细胞器相继被发现,20世纪30年代电子显微镜技术的问世,是细胞形态的研究达到了空前的高潮。20世纪50年代分子生物学的兴起,推动细胞生物学的研究进入了分子水平。
1. 1831 英国人Robert Brown 发现植物细胞核。
2. 1832 德国人?C. J. Dumortier 观察了藻类的细胞分裂,并认为细胞来源于原来存在的细胞。
3. 1835 德国人H. von Molh 仔细观察了植物的细胞分裂,认为是植物的根和芽尖极易观察到的现象。
4. 1835 法国人F. Dujardin 观察动物活细胞时发现“肉样质”(Sarcode)。
5. 1839 捷克人J. E. Pukinye 用protoplasm这一术语描述细胞物质,“Protoplast”为神学用语,指人类始祖亚当。
6. 1841 波兰人R. Remak发现鸡胚血细胞的直接分裂(无丝分裂)。
7. 1846 德国人H. von Mohl研究了植物原生质,发表了“identifies protoplasm as the substance of cells”。
8. 1848 德国人W. Hofmeister 描绘了鸭跖草Tradescantia的花粉母细胞,明确的体现出染色体,但他没有认识到之一重要性,40年后德国人H. von Waldeyer因这一结构可被碱性染料着色而定名为Chromosome。
9. 1861 德国人M. Shultze 认为动物细胞内的肉样质和植物体内的原生质具有同样的意义。他给细胞的定义是:“the cell is an accumulation of living substance or protoplasm definitely delimited in space and possessing a cell membrane and nucleus。”
10. 1864 德国人Max Schultze 观察了植物的胞间连丝。
11. 1865 德国人J. von Suchs 发现叶绿体。
12. 1866 奥地利人G. Mendel 发表了对豌豆的杂交试验结果,提出遗传的分离规律和自由组合规律。
13. 1868 英国人T. H. Huxley 在爱丁堡作题为“生命的物质基础”(the physical basis of life)的演讲报告时首次把原生质的概念介绍给了英国公众。
14. 1869 瑞士人F. Miescher 从脓细胞中分离出核酸。
15. 1876 德国人O.Hertwig发现海胆的受精现象,其论文题目为“observe the fertilization of a sea urchin egg”。
16. 1879 德国人W. Flemming观察了蝾螈细胞的有丝分裂,于1882年提出了mitosis 这一术语。后来德国人E. Strasburger(1876~80)在植物细胞中发现有丝分裂,认为有丝分裂的实质是核内丝状物(染色体)的形成及其向两个子细胞的平均分配,动植物的受精实质上是父本和母本配子核的融合,并于1984提出了Prophase和Metaphase的概念。
17. 1882 德国人E. Strasburger 提出细胞质(cytoplasm)和核质(nucleoplasm)的概念。
18. 1883 比利时人E. van Beneden 证明马蛔虫Ascaris megalocephala配子的染色体数目是体细胞的一半,并且在受精过程中卵子和精子贡献给合子的染色体数目相等。
19. 1883 比利时人E. van Beneden和德国人T. Boveri发现中心体。
20. 1884 德国人O.Hertwig和E. Strasburger提出细胞核控制遗传的论断。
21. 1886 德国人A. Weismann 提出种质论。
22. 1890 德国人Richard Altmann 描述了线粒体的染色方法,他推测线粒体就像细胞的内共生物,并认为线粒体与能量代谢有关。他还于1889年提出了核酸的概念。
23. 1892 德国人T. Boveri和O. Hertwig研究了减数分裂的本质,并描述了染色体联会现象。
24. 1898 意大利人C. Golgi 用银染法观察高尔基体。
25. 1900 孟德尔在34年前发表的遗传法则被重新发现。
26. 1905 美国人Clarence McClung shows that female mammals have 2 X chromosomes and that males have an X and a Y
27. 1908 美国人T. H. Morgan以Drosophila melanogaster为材料开始著名的遗传学实验,1910年提出遗传的染色体理论,1919年发表“遗传的本质”(Physical Basis of Heredity)。1926年发表“基因学说”(The Theory of the Gene)
28. 1910 德国人A. Kossel获得诺贝尔生理医学奖,他首先分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸。
29. 1935 美国人W. M. Stanley 首次得到烟草花叶病毒的结晶体。
30. 1940 德国人G. A. Kausche和H. Ruska 发表了世界第一张叶绿体的电镜照片。
31. 1941 美国人G. W. Beadle和E. L. Tatum提出一个基因一个酶的概念。
32. 1944 美国人O. Avery,C. Macleod 和M. McCarthy等人通过微生物转化试验证明DNA是遗传物质。
33. 1945 美国的K. R. Porter、A. Claude 和 E. F. Fullam发现小鼠成纤维细胞中的内质网。
34. 1949 加拿大人M. Bar发现巴氏小体。
35. 1951 美国人James Bonner发现线粒体与细胞呼吸有关。
36. 1953 美国人J. D. Watson 和英国人F. H. C. Crick提出DNA双螺旋模型。
37. 1955 比利时人C. de Duve发现溶酶体和过氧化物酶体。
38. 1955 美国人Vincent Du Vigneaud因人工合成多肽而获诺贝尔奖
39. 1956年,蒋有兴(美籍华人)利用徐道觉发明的低渗处理技术证实了人的2n为46条,而不是48条。
40. 1957 J. D. Robertson[2]用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片,显示暗-明-暗三层结构。
41. 1961 英国人P. Mitchell 提出线粒体氧化磷酸化偶联的化学渗透学说,获1978年诺贝尔化学奖。
42. 1961~64 美国人M. W. Nirenberg破译DNA遗传密码。
43. 1968 瑞士人Werner Arber从细菌中发现DNA限制性内切酶。
44. 1970 美国人D. Baltimore、R. Dulbecco 和H. Temin由于发现在RNA肿瘤病毒中存在以RNA为模板,逆转录生成DNA的逆转录酶而获1975共享诺贝尔生理医学奖。
45. 1971 美国人Daniel Nathans 和Hamilton Smith发展了核酸酶切技术。
46. 1973 美国人S. Cohen和H. Boyer将外源基因拼接在质粒中,并在大肠杆菌中表达,从而揭开基因工程的序幕。
47. 1975 英国人F. Sanger设计出DNA测序的双脱氧法。于1980年获诺贝尔化学奖。此外Sanger还由于1953年测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。
48. 1982 美国人S. B. Prusiner发现蛋白质因子Prion,更新了医学感染的概念,于1997年获诺贝尔生理医学奖。
49. 1983 美国人K. B. Mullis发明PCR仪,1987年发表了 “Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction”,于1993年获诺贝尔化学奖。
50. 1984 德国人G. J. F. Kohler、阿根廷人C. Milstein[3]和丹麦科学家N. K. Jerne由于发展了单克隆抗体技术,完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。
51. 1989 美国人S. Altman和T. R. Cech由于发现某些RNA具有酶的功能(称为核酶)而共享诺贝尔化学奖。Bishop和Varmus由于发现正常细胞同样带有原癌基因而分享当年的诺贝尔生理医学奖。
52. 1997 多利羊在卢斯林研究所诞生,成为世纪末的重大新闻。多利是Ian Wilmut领导的研究小组克隆的(图1-3)。

图1-3 多利和邦妮(图片来自http://www.ri.bbsrc.ac.uk)
53. 1998 美国人T. Wakayama和R. Yanagimachi成功地用冻干精子繁殖出小鼠。
54. 2000 世界首例克隆猪在苏格兰诞生,是由Alan Coleman领导的研究小组克隆的。
55. 2001 美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。
56. 2002 英国人Sydney Brenner、美国人H. Robert Horvitz和英国人John E. Sulston,因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理学或医学奖。
57. 2003 美国科学家Peter Agre和Roderick MacKinnon,分别因对细胞膜水通道,离子通道结构和机理研究而获诺贝尔化学奖。
[1]德国植物学教授,性格暴躁、反复无常。原在Heiderberg学法律,后来在Hamberg当律师,因工作不顺利自杀而未遂。枪伤痊愈后在哥廷根大学和柏林大学研究植物学和医学,获博士学位
[2] 1957. New observations on the ultrastructure of the membranes of frog peripheral nerve fibers. J. Biophys. Biochem. Cytol. 3:1043-1047.
1959 The ultrastructure of cell membranes and their derivatives. Biochem. Soc. Symp. 16: 3-43
[3] 出生于阿根廷,具有英国和阿根廷国籍,在美国获奖。
第二节 细胞生物学学习方法
第一、认识细胞生物学课程的重要性,正如原子是物理性质的最小单位,分子是化学性质的最小单位,细胞是生命的基本单位。50年代以来诺贝尔生理与医学奖大都授予了从事细胞生物学研究的科学家,可见细胞生物学的重要性。如果你将来打算从事生物学相关的工作,学好细胞生物学能加深你对生命的理解。
第二、明确细胞生物学的研究内容,即:结构、功能、生活史。生物的结构与功能是相适应的,每一种结构都有特定的功能,每一种功能的实现都需要特定的物质基础。如肌肉可以收缩、那么动力是谁提供的、能量从何而来的?
第三、从显微、超微和分子三个层次来认识细胞的结构与功能。一方面每一个层次的结构都有特定的功能,另一方面各层次之间是有机地联系在一起的。
第四、将所学过的知识关联起来,多问自己几个为什么。细胞生物学涉及分子生物学、生物化学、遗传学、生理学等几乎所有生物系学过的课程,将学过的知识与细胞生物学课程中讲到的内容关联起来,比较一下有什么不同,有什么相同,为什么?尽可能形成对细胞和生命的完整印象,不要只见树木不见森林。另一方面细胞生物学各章节之间的内容是相互关联的,如我们在学习线粒体与叶绿体的时候,要联想起细胞物质运输章节中学过的DNP、FCCP等质子载体对线粒体会有什么影响,学习微管结构时要问问为什么β微管蛋白是一种G蛋白,而α微管蛋白不是,学习细胞分裂时要想想细胞骨架在细胞分裂中起什么作用,诸如此类的例子很多。
第五、紧跟学科前沿,当前的热点主要有“信号转导”、“细胞周期调控”、 “细胞凋亡”等。细胞生物学是当今发展最快的学科之一,知识的半衰期很短(可能不足5年),国内教科书由于编撰周期较长,一般滞后于学科实际水平5-10年左右,课本中的很多知识都已是陈旧知识。有很多办法可以使你紧跟学科前沿:一是选择国外的最新教材,中国图书进出口公司读者服务部http://link.clubol.com/link/index.php那里可以买到很多价廉物美的正宗原版教材(一般200-400元,只相当于国外价格的1/5);二是经常读一些最新的期刊资料,如果条件所限查不到国外资料,可以到中国期刊网、万方数据等数据库中查一些综述文章,这些文章很多是国家自然科学基金支助的,如在中国期刊网的检索栏输入关键词“细胞凋亡”,二次检索输入关键词“进展”,你会发现一大堆这样的文章,都是汉字写的比读英文省事。
第六、学一点科技史,尤其是生物学史,看看科学家如何开展创造发明,学习他们惊人的毅力、锐敏的眼光和独特的思维。牛顿说过:“我之所以比别人看得更远,是因为站在巨人的肩膀上。”
第三节 对未来的展望
人类经历了漫长的采猎文明后,约在一万年前进入农业经济时代,18世纪60年代,英国率先进入工业经济,20世纪50美国最早走完工业经济的历程,进入信息时代。据专家估计这一经济形态的“寿命”为75~80年,到本世纪20年代将渐渐失去活力,届时人类迎接下一个经济时代,即生物经济时代的到来,生物经济的资源为基因,其核心技术为建立在细胞与分子生物学理论基础上的各类生物技术。
生物经济时代特点是:
1. 基因克隆和重组技术日趋成熟,人类将根据经济需要去开发和操纵遗传资源,如通过转基因的方法生产人类生长素、干扰素(每千克价值440亿美元)等昂贵的药物;培育具有特殊功能的转基因动植物,如具有苏云金毒素的抗虫棉。在商业目的的驱使下,大量的改造物种,开始了偏离自然进化规律的二次“创世纪”,由此所产生的基因污染和伦理问题将越来越突出。
2. 人类基因组[4]大约10万个基因的作图和测序完成,进入以揭示基因功能为主的后基因组计划,人类遗传病的基因治疗成为常规技术。
3. 动物克隆技术和人类干细胞定向分化技术取得突破,人工创建的组织,器官将用于医学治疗的目的。
4. 神经生物学、信息生物学、细胞生物学等学科的发展,为实现人工智能奠定了理论基础。
5. 基因武器可能成为继核武器以后又一种足以令人类毁灭的武器。
6. 生物芯片[5](图1-4)技术广泛应用于科研、医疗、农业、食品、环境保护、司法鉴定等领域。成为与晶体管芯片一样重要的产业。
7. 植物光合作用机理研究取得重大突破,人工光解水产生的氢气成为及化石燃料之后主要的能源。
8. 计算机和网络系统为生物经济的遗传信息管理和交流提供了方便。

图1-4 DNA芯片(图片来自http://www.ornl.gov)
[4]人类基因组计划(Human genome project)由美国于1987年启动,我国于1993年加入该计划,承担其中1%的任务,即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。2000年6月28日人类基因组工作草图完成。由于人类基因测序和基因专利可能会带来巨大的商业价值,各国政府和一些企业都在积极地投入该项研究,如1997年AMGE公司转让了一个与中枢神经疾病有关的基因而获利3.92亿美元。
[5]生物芯片技术是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同,可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”,也被称为基因芯片(Gene chip)或DNA芯片(DNA chip)。1998年6月美国宣布正式启动基因芯片计划,联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入,以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起,目前美国已有8家生物芯片公司股票上市,平均每年股票上涨75%,据统计全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右,预计今后5年之内,生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。
附录 细胞生物学参考书
1. Bruce Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 4th. Garland Science, 2002.
2. Harvey Lodish et al. Molecular Cell Biology 4th. W. H. Freeman and Company, 1999.
3. Gerald Karp. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments 3rd. Wiley & Sons, 2002.
4. 韩贻仁. 分子细胞生物学科学出版社. 2001年03月.
5. 印莉萍, 刘祥林. 分子细胞生物学实验技术. 首都师范大学出版社.2001年01月.
6. 牛富文. 医用分子细胞生物学. 河南医科大学出版社.1997年06月.
7. 罗深秋. 医用细胞生物学.军事医学科学出版社. 1998年08月.
8. 陈诗书. 医学细胞与分子生物学. 上海医科大学出版社. 1999年01月.
9. 周建明. 医学细胞与分子生物学. 上海医科大学出版社.1997年06月.
10. 高文和. 医学细胞生物学. 天津大学出版社.2000年09月.
11. 左及. 医学细胞生物学. 上海医科大学出版社.1999年06月.
12. 余从年. 医学细胞生物学导论. 科学出版社. 2000年07月.
13. 郭葆玉. 细胞分子生物学实验操作指南. 安徽科学技术出版社1998年04月.
14. 王德耀. 细胞生物学. 上海科学技术出版社.1998年.
15. 翟中和. 细胞生物学. 高等教育出版社.1995年1月.
16. 翟中和. 细胞生物学.高等教育出版社.2000年8月.
17. 汪堃仁. 细胞生物学(第二版). 北京师范大学出版社.1998年11月.
18. 郑国锠. 细胞生物学(第二版). 高等教育出版社.1992年04月.
19. 翟中和. 细胞生物学动态-第一卷. 北京师范大学出版社.1997年03月.
20. 翟中和. 细胞生物学动态. 第二卷. 北京师范大学出版社.1998年10月.
21. 翟中和. 细胞生物学动态-第三卷. 北京师范大学出版社1.999年.
22. 辛华. 细胞生物学实验.科学出版社. 2001年02月.
23. 刘鼎新. 细胞生物学研究方法与技术(第二版). 北医、协和医大联合出版社.1997年05月.
24. 杨汉民. 细胞生物学实验(第二版). 高等教育出版社.1997年07月.

第一节 显微技术
显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同,可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光(紫外线显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。
—、光学显微镜
(一)、普通光学显微镜
普通生物显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体,为了消除球差和色差,目镜和物镜都由复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定材料和观察方便(图2-1)。

图2-1 尼康E-600显微镜
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率,用公式表示为:
R=0.61λ /N.A. N.A.=nsinα/2
式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。
表2-1 及中介质的折射率
|
介质 |
空气 |
水 |
香柏油 |
α溴萘 |
|
折射率 |
1 |
1.33 |
1.515 |
1.66 |
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。
普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
(二)、荧光显微镜

图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜
细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

图2-3 落射式照明原理
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别:
1. 照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3);
2. 光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜;
3. 有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人目。

图2-4 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自http://www.itg.uiuc.edu
(三)、激光共聚焦扫描显微境

图2-5 激光共聚焦扫描显微镜

图2-6 LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自http://www.itg.uiuc.edu
激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。
(四)、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。

图2-7 暗视野照明方式
(五)、相差显微镜
相差显微镜(phasecontrast microscope,图2-8、9)由P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:
1. 环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
2. 相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:
1. A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。
2. B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。

图2-8 相差显微镜照明原理

图2-9 一种介壳虫的染色体(PCM照片)
(六)、偏光显微镜
偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。
(七)、微分干涉差显微镜
1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图2-10)。

图2-10 DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)
DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。
(八)、倒置显微镜
组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。

图2-11 莱卡倒置显微镜
进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体,从而操作灵活,使用方便。
二、电子显微镜
(一)、透射电子显微镜
1、基本原理
在光学显微镜下无法看清小于0.2µm的细微结构,这些结构称为亚显微结构(submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures;ultrastructures)。要想看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),电子束的波长要比可见光和紫外光短得多,并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。
电子显微镜(图2-12)与光学显微镜的成像原理基本一样,所不同的是前者用电子束作光源,用电磁场作透镜。另外,由于电子束的穿透力很弱,因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机(ultramicrotome)制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
表2-2不同光源的波长
|
名 称 |
可见光 |
紫外光 |
X射线 |
α射线 |
电子束 | |
|
0.1Kv |
10Kv | |||||
|
波长(nm) |
390~760 |
13~390 |
0.05~13 |
0.005~1 |
||