五：在医学各领域中的应用举例
１、对多项指标的定性、及动态变化检测：
同时测定细胞内游离钙离子和ＰＨ值的动态变化
细胞受各种因素作用时，胞内Ca2+和pH发生变化，不过由于缺乏能同时检测胞内Ca2+和pH动态变化的方法，二者之间的关系仍不很清楚。近年来，随着激光扫描共聚焦显微镜技术和荧光探针的开发利用，新一代的胞内游离Ca2+探针fluo-3/AM(13-15)（典型的单波长荧光探针，发射波长较长，荧光选择性强，自身无荧光，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解并与游离钙结合后才发出荧光，能有效地避免非特异性染色，不需要紫外光激发，避免了紫外光对活细胞样品的损伤，不需要制作工作曲线。）和pH荧光探针SNARF-1/AM被分别用于胞内游离Ca2+和pH变化的检测。根据fluo-3/AM和胞内游离Ca2+结合后在波长530 nm处荧光强度随游离Ca2+浓度升高而增强，而SNARF-1的荧光强度在波长>605 nm时随胞内pH升高而增强，利用它们的激发波长均为480 nm以及fluo-3/AM的荧光强度不受SNARF-1/AM影响等特点，用二者分别标记小鼠腹腔巨噬细胞，在激光扫描共聚焦显微镜下，同时用最适发射波长分别为530 nm和大于605 nm的检测器1和检测器2检测巨噬细胞内fluo-3和SNARF-1的荧光强度变化。如图３所示：小鼠巨噬细胞未受到刺激时，fluo-3和SNARF-1荧光强度同样不变。加入维拉帕米（终浓度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的荧光强度下降了0.42，SNARF-1/AM的荧光强度下降了0.22．如图４所示：加入肾上腺素（终浓度1×10μmol/L）后200 s，fluo-3/AM的荧光强度上升0.36，SNARF-1/AM荧光强度下降0.21。
2、定量检测：
以测定细胞内游离钙离子浓度为例：
indo-1是典型的双发射荧光探针，用355nm光激发时，其发射光谱发生变化：无钙时，在485nm左右有个发射峰；结合钙后，在405nm处有发射峰。两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，此比值与工作曲线相比即可得出细胞内游离钙的浓度。因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度，其优点为用两个接收装置同时采集双发射波长光学信号，可增加时间分辨率，不易进入细胞器，缺点为光褪色较快，其发射光谱的短波区可能受细胞内自发荧光的影响。
3、三维重组：
观察冻存对卵母细胞的影响(16)：
运用激光扫描共聚焦显微术的光学切片和三维图像重建技术研究冻存对自发性高血压大鼠（SHR）卵母细胞的结构尤其是对纺锤体、染色体的影响，以及冻存对体外受精的影响。方法：将冻存复苏后形态正常的卵母细胞放入已获能的精子悬液中，10小时后取出卵母细胞，固定。固定后的卵母细胞经特定荧光染料染色后，用CLSM进行观察。Ex488,EmBP505-550nm的波长用于观察减数分裂纺锤体或微管的信号;Ex361,EmBP385-470nm用来观察染色体的兰色荧光。
结果：通过激光扫描共聚焦显微镜来评价冻存后胚胎的形态学存活率，凡是透明带完整(质膜完整以及折光均匀的细胞质的卵母细胞被认为形态学存活。经过冻存后只有42.9%的卵母细胞形态正常图5.1是一个冻存后形态学正常的卵母细胞。
