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激光共聚焦扫描显微镜技术
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2007-3-6

    三、主要技术指标:
    1)、xy分辨率:Rxy=0.4波长/数值孔径,是传统显微镜Rxy(0.61波长/数值孔径)的1.4倍,但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很多,它是连接这两种常规技术的中间桥梁(11)。
    2)待测样品最大厚度:约1-2mm.
    3)样品最小光切厚度:40nm
    4)Z轴最大分辨率:0.35um.

    四、生物学应用:
    共聚焦显微镜技术随着荧光探针及激光器的迅速发展,已越来越被广泛的应用于生物医学各个研究领域.
    1 、细胞间通讯的研究:多细胞生物体中,细胞间相互影响和控制的生物学过程称为细胞间通讯,它被认为在细胞增殖和分化中起着非常重要的作用,激光扫描共聚焦显微镜可测量传递细胞调控信息的一些离子、小分子物质。
    2 、荧光的定量定位分析:激光扫描共聚焦显微镜可对单、双或三标的细胞及组织标本的荧光进行定量定位分析,也非常适合于高灵敏度的快速免疫荧光测定,可以准确监测抗原表达、荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析。
    3 、细胞物理化学测定:激光扫描共聚焦显微镜可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗数等参数进行自动测定。能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA, RNA,酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。
    4 、粘附细胞的分选:细胞分选有两种方式,一种适用于数量较多细胞的分选,即在特制的培养皿上有两类细胞,一类是未作荧光染色的细胞群,另一类是作荧光染色的细胞群,利用高能激光把染色的细胞群杀死,而把未染色的细胞群保留并且继续培养。一种适用于数量较少的突变细胞,转移细胞和杂交瘤细胞,即利用高能量激光于底部带膜的特制培养皿上在欲选细胞周围切割成八角带,而非选细胞则因在该几何形状之外而除去。
    5、 pH、细胞内离子分析:利用荧光探针,激光扫描共聚焦显微镜可对细胞内各种离子的含量及动态变化作毫秒级定时定量分析,较多的是对细胞内钙离子浓度及浓度变化的测量。利用SNAFI类探针可对细胞内pH进行测定。
    6 、激光细胞显微外科手术:激光扫描共聚焦显微镜将激光作“光子刀”使用,进行细胞瞬间穿孔,染色体精确切割,细胞器烧灼,神经元突起切除等一系列细胞外科手术。
    7 、光陷阱技术该技术利用激光的力学效应将一个微米级大小的细胞器或其它结构钳于激光束的焦平面也可称为光钳。利用光钳移动细胞的微小颗粒和结构(如染色体、细胞器)进行细胞融合,机械刺激及细胞骨架弹性测量等
    8 、细胞膜流动性测定:细胞膜荧光探针受到极化光线激发后,其发射光极性依赖于荧光分子的旋转,该旋转依赖于膜的流动性,因此极性测量可间接反映膜的流动性,激光扫描共聚焦显微镜利用专用机算机软件可对细胞膜的流动性进行定量和定性分析
    9 、光活化技术:生物体内许多重要的活性物质和化合物均可形成笼锁化合物。激光扫描共聚焦显微镜即具有光活化测定功能,可控制使笼锁探针分解的瞬间光波长和照射时间,从而人为地控制多种生物活性产物及其它化合物发挥作用的时间和空间。
    10 、组织光学切片及三维图像重建:共聚焦成像利用照明点与探测点共扼这一特性,可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光,因而具有深度识别能力及纵向分辨率,可着到较厚生物标本的细节,以一个徽动步进马达,可以逐层获得二维光学横断面图像,所以被形象地称"显微CT"。标本的各层光学切片经计算机图像处理及三维重建软件,可以得到其三维立体结构,从而进行各侧面直观的形态学观察
    11、 荧光漂白恢复(FRAP)技术:此技术借助于高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,用激光扫描共聚焦显微镜可直接对此扩散速率进行检测,由此揭示细胞和各种变化的机制,因而可以研究细胞骨架构成、核模结构和大分子组装等
    12 、多光子技术:现在多家公司开发出多光子LSCM,多光子技术就是使一个荧光分子同时吸收两个或两个以上光子的技术。这样就可以利用数个低能光子同时释放的能量代替单个高能光子的作用。这项技术的使用使我们可以采用长波长激发光达到短波长激发光的激发效果,尤其是无需使用紫外光源而达到检测紫外探针的目的。其主要特性表现为:(1)长波长激光尤其是红外激光穿透力强,使我们能观察样品更深层的细节。(2)由于低能光子的能量只有在焦面处才增强到能够激发出荧光,因此大大减小了光束所经过的细胞或组织部分的光漂白现象,使被检测细胞所受的光损伤大大减小,从而延长了对活体的观察时间。

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