3.3 上样品、设置仪器
14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中ý Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击Acquire。
调节FSC/SSC探测器（电压）
15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain 从1.00—9.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的Pause。
Gating 圈选
细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。
16. 在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品
时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates → Region list ，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。
17. 选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。
调节FL1、FL2的探测器（电压）
18. 点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节FL1、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。
19. 在Threshold 窗口，适当地提高FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。
20. 点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。
调节荧光补偿
说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿
21. High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击¯来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。
