1.4 光辉霉素和PI的DNA染色
在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时也适用于体外培养的细胞。
(1)分离制备的细胞悬液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光辉霉素染色，4℃1小时（PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L）。
(3)染色后进样，以100W汞灯作为激光光源，使用BG123nm阻断滤片，叠加K590型高通滤法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下：
(1)试剂：
溶液A：低温保存，稳定期约2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL
1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL，PH1.5（100mL）
溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL
蒸馏水24mL，总体积为99mL pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。
注意：仪器鞘流系统应保持4℃。
氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×106细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。
③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。
注意：①细胞数保持恒定；②核酸与吖啶橙的比例；③染色时间及温度。
(三)染色法的应用
1、变性及双链DNA的鉴别染色
(1)试剂：
HBSS内含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4 缓冲液，pH2.6。
①2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃温育1小时。
③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30分钟。
④加2mL吖啶橙染色2分钟。
⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。
2、DNA与癌基因探针双标记测定
这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物，然后用PI标记DNA，现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤：
(1)制备白血病细胞悬液，用100%甲醇在-20℃固定10分钟。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性地直接与N-ras，Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合)，4℃作用30～45分钟。
(3)用PB离心洗涤2次，重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分钟。
(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG，4℃反应30～45分钟。
(6)同(3)洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温20～30分钟。
(7)同(3)洗涤后，用PI染液染20分钟。
(8)同(3)洗涤后，用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物，PI染色显示DNA含量。
注意事项：
①制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集；
②细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂；
③为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净；
④进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。
