把样品调焦清 (Set sharpness)：如图5a所示，双眼望进显微镜的视野中, 这时可分别用粗或细调焦旋钮把物台慢慢向下调, 待视野中显现出样品的初步细节时, 就只能改用细调焦旋钮缓缓调节, 使视野中的组织切片像的细节调到最为清晰, 如图5b所示
把视场光阑收小, 视野中变暗并出现一个模糊的(多边)亮斑, 这便是视场光阑的模糊像, 它不会正好在视域的中央, 而是偏向视域的某一部位, 如图6 所示为偏向左上方.
利用聚光镜的高低位置调节旋钮, 如图7a所示, (由于在第步序中已把聚光镜升到可能的最高位置上), 把聚光镜缓缓向下调, 使视场光阑的模糊像逐渐变为清晰的多边形象, 为便于判断, 可把视场光阑稍微开大些, 如图7b所示.
调节聚光镜上的调中螺丝 (Centering screws), 如图8a 所示, 把多变形像调向视域中央, 过程与方法如下: 把视
场光阑开大到几乎要充满整个的视域如图8b, 这时看一看光阑像的边缘, 就会看到它的外围留有狭窄而黑暗的环形边缘部份, 这时判断一下多边形的边缘与圆形视域的间距, 如果几乎相等时, 就可视场光阑再稍为开大些.
在上一步序中, 把视场光阑再稍为开大些, 目的在于使视场光阑
更接近视域的边缘, 让它成为视域的内接多边形, 以便进一步验证其调中的情形, 如图9所示, 有偏差时, 微微再做些少工夫就可以了.
当视场光阑完全调中后, 只要再稍微开大视常光阑, 使多边形像
正好移出视域边缘, 如图10所示. 这就是调中完成後的视域, 成像由中央到边缘的照明亮度很是均匀, 由于视场光阑的大小正好开大到消失在视域边缘上, 视域以外的杂散光都被阻挡掉, 视域中就不会有杂散光的干扰了. 现在几乎已获得了相当好的显微成像, 只是成像的反差还有待于改善.
记得调试开始时的第步序中, 曾把孔径光阑完全开大, 目的在于让更多的照明光进入视域中, 现在有必要作一些改正以获得较好的反差. 换言之, 孔径光阑不可以收得太小, 否则会降低成像细节的分辩率. 把目镜从其双目镜筒的座子上取出, 如图11a所示, 就可把眼睛在离镜筒口约10-20mm处望进目镜筒内就可看到物镜出射光瞳的像, 定义它的大小为100%, 如图11b所示. 调大调小聚光镜上的孔径光阑直至可在物镜出射光瞳面上确认出它的大小, 最后, 把孔径光阑像的大小调到等于物镜出射光瞳直径的2/3 (66 %) 至 4/5 (80 %), 如图11c所示. 这样调整之后，显微镜的成像也达到了几乎最大的分辩率与最佳的反差. 由于只有最佳反差的成像才能使眼睛感觉到最好, 因此, 通常是要在分辩率上作这样的折衷.
插回目镜并看进显微镜中, 至此, 显微镜已用先前的物镜(即10x) 按库勒照明系统的要求作好了调整. 现在就可以开始想要进行的工作. 然而, 如果换用其它倍率更高的物镜, 千万要记住, 必须重调视场光阑和孔径光阑！例如：换用40x的物镜时, 由于所看到的样品范围小了, 就要把视场光阑收小并检查其调中状况; 同时由于倍数较高的物镜其数值孔径也较大, 所以聚光镜的孔径光阑也要相应开大一些. 总而言之, 每换用一个倍数的物镜, 就要把这两个重要的光阑按前述的步骤重调或检查核对一下.
