3. GFP 绿色荧光蛋白
GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.
GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察
如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的
结构及病理过程:定位与定量测量应注意的问题
定位：1.可以对图像进行修饰，
2.pinhole 可尽可能的小。
3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像
定量：
1.仪器的各个条件必须一致
2.必须用原始图像进行定量测量
3.Pinhole尽可能的大
六.显微CT与三维重组
光切的层数：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.动态测量 Physiology:细胞内离子动态变化测量
1).游离Ca2+测量
检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
荧光探针 激发波长 发射波长 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM
相对 测量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+浓度绝对测量
单波长公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)
Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)
测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）
细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）
细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
标准曲线法：根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度
比例荧光的测量：双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2
细胞器的Ca2+测量
1.线粒体内游离Ca2+测量 Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）
2. 特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光 用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测
