2 长度测量
DNA电镜技术的显著优点是能从混合分子群体中显示单个DNA分子的特征,并且利用电镜测量DNA分子大小,常比其他方法更为准确。DNA分子大小过去常用分子量(dalton)或碱基(bp)表示。1bp的DNA约为(2.08±0.03)×106 daltons,相当于3.14 kb。根据电镜图像DNA的长度,即可粗略计算其相对分子质量大小。样品在展开过程中展开力对DNA的作用及测量误差会对测量结果产生影响。为排除这些因素的影响,制样时应加入已知相对分子质量的DNA分子作为标准,根据长度比值,也可精确地计算出DNA的长度大小。常用作标准的DNA分子有SV40、pBR322、Φx174RFⅡ、fd DNA等。线性DNA分子一般不能用作标准。制样时加入已知浓度及大小的DNA电镜下也可精确测定DNA浓度。这些测定仅需5 μg DNA。
3 DNA∶DNA异源双链绘图
异源双链方法可以检测不同类型DNA分子间的同源序列。将两种DNA分子进行碱变性或热变性后退火,同源序列部分杂交呈双链结构,非同源部分不能配对,在甲酰胺存在情况下维持双链状态,电镜下可显示三种结构特征:(1)除插入或缺失外,在两种DNA分子均相同时,插入或缺失部分在双股异源双链分子中呈单链插入/缺失环;(2)两种相同的DNA分子某一区域为其他序列取代,替代区域形成两股不能配对的单链(即替代环);只有小段DNA相同时,则形成一短的双股区,两侧为不能配对的单链;(3)许多单个碱基不同的两种DNA分子形成间隔异源双链含一系列单链及双链区,电镜下可以确定其位置及长度,能识别50~100 bp长的缺失/替代环。异源双链方法已成功用于噬菌体及病毒DNA缺失、替代、插入、重复区域的定位及长度测量,阐明了爪蟾的rDNA基因及间隔子的排列,发现了侧枝移动现象,确定了Ig可变区的编码区域。
4 标记方法
细胞色素C及无蛋白展层技术很难观察到结合于DNA上的相对分子质量小于50 000的蛋白,也不能识别小于100 bp的DNA∶DNA或RNA∶DNA杂交体。但如果将电子致密物铁蛋白或胶体金标记到目的分子上再用传统方法制样即可解决此问题。
铁蛋白(Mr 900 000)具有电子致密核心,可以用化学方法直接偶联到核酸分子的3′末端。由于铁蛋白分子较大,会损害探针的生物特异性及结合活性,因此利用生物素-(链霉)亲和素的高亲和反应性,建立了间接标记方法。生物素(Mr244)比铁蛋白小得多,可与亲和素[Mr 68 000]或链霉亲和素(Mr 68 000)高亲和力结合。生物素可以偶联到抗体和其他蛋白上;生物素化核苷酸可以掺入核酸分子内或加到RNA的3′末端。生物素化分子与偶联铁蛋白的亲和素或链霉亲和素结合后即可在电镜下进行观察。利用此技术成功地进行了DNA剪切修复区的观察及DNA末端标记,并对Ad2、Φ290噬菌体DNA的末端蛋白进行了观察。用铁蛋白标记观察到SV40的T抗原结合位点及SV40DNA复制起始区。抗原-抗体反应使DNA结合蛋白的信号特异性增强,单抗技术及电子致密物标记抗体的问世加速了此反应在标记技术中的应用。此外,Wu及Davidson建立了一种DNP-抗-DNP方法标记DNA结合蛋白。首先,二硝基氟苯与DNA结合的蛋白反应,二硝基苯酚(DNP)及抗原结合到蛋白的氨基基团,再与抗DNP抗体反应,尔后结合铁蛋白或胶体金标记的抗IgG;也可结合生物素化抗IgG或生物素化SPA,再与偶联蛋白或胶体金(链霉)亲和素结合。此法对Ad2 DNA末端蛋白的标记率可达78%。样品可以用细胞色素C展层技术制备,并且经过双重标记可以在电镜下观察到相对分子质量小于6 000的蛋白。
5 活性基因观察
1969年Miller等建立了染色体展层技术,尔后应用于原核及真核系统核糖体基因体内转录的观察,首次在电镜下观察到真核活性转录基因的染色体结构。首先从核仁中分离大部分核仁蛋白,获得核仁染色体成分rDNA染色质,用于阐明前rRNA基因初级转录单位的基本结构排列。基因区在电镜下为以DNA为轴心的DNA-蛋白细丝,被RNA聚合酶分子覆盖,约有100多个同时转录的RNA聚合酶颗粒。聚合酶颗粒在基因5′端(转录起始部位)及3′末端(转录终止部位)有明显的界限。随着转录进行,新生的互补RNA转录不断延长,并形成特定的构象,在转录终止部位呈复杂的核糖核蛋白(RNP)细丝结构。因此,Miller染色体展层技术获得了有关基因功能的重要的形态结构资料。有关核仁分离及电镜样本制备技术及改进,Trendelenburg等进行了详细描述。
电镜下可观察克隆的真核基因在异种系统内的表达。将含有昆虫rRNA基因的环形DNA注入蛙卵母细胞,展开制样后电镜下有可能识别注入的DNA上的起始转录并进行特异性分析;注入环状DNA有助于确定观察到的转录复合体是起源于注入的DNA抑或是内源性DNA。腺粒体DNA也能装配成染色质样结构,那么它很有可能成为分析克隆的单拷贝基因转录活性、初级转录物的结构及其加工的有力工具。

