常用的富集方法有：固定金属亲和色谱(IMAC)，IMAC是选择性分离和富集磷酸化肽最广泛的方法。此方法中, 键合在螯合底物上的金属离子(通常是Fe3+或Ga3+)选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合, 并且在高pH 或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来。抗体免疫沉淀，高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。目前利用抗体富集蛋白/肽仅局限于分析磷酸化酪氨酸, 然后用MALDI－TOF MS分析与抗体相联接的磷酸化肽。尽管用于免疫沉淀的抗体对其底物必须有相对高的亲和力, 但低亲和力抗体仍然可以有效地用于免疫印迹Western-blotting分析。化学修饰，已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白/肽的方法[15,16]。但两种方法都有待进一步优化以鉴定低丰度蛋白质。
磷酸化肽的检测和磷酸化位点的确定主要有以下MS技术：MALDI-TOF MS 可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点。其原理是磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。串联质谱(MS/MS) 可进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4 (98 u)的肽段。另外，由于液相色谱分离肽降低了离子抑制效应，也有人用LC-MS/MS分析磷酸化位点。傅立叶变换质谱进行电子捕获解离 电子捕获解离(ECD)与傅立叶变换离子回旋加速共振(FTICR)质谱相连是蛋白质、肽测序和研究蛋白质翻译后修饰的一个有力方法。近来，它已被成功地用于鉴定肽片段上发生磷酸化的残基。
五、 小结
目前,生物质谱被认为是大规模、高通量进行蛋白结构鉴定的首选工具,但与之结合的2-D电泳仍有缺点,如工作量大,重现性差。因此,将对其进行改进,如分子扫描技术等。由于通过LC-MS/MS可直接鉴定蛋白混合物,因此将来有望不通过2-D 就能研究蛋白质组。当然,这还需要解决一些技术问题,其中最根本的是质谱的定量问题。生物质谱的魅力在于它能帮助我们研究蛋白- 蛋白间相互作用、翻译后修饰乃至基因表达水平的变化等。相信,随着生物质谱技术和数据采集软件技术的不断飞速发展,我们将能够获得这方面的更多信息,从而揭示出生命活的奥秘。
参考文献
[1]Timothy Palzkill, Proteomics, Kluwer Academic publishers, 2002
[2]曾嵘，夏其昌，蛋白质组，现代科学仪器，2000，5：5-9
[3]杨松成，蛋白质组学中的有机质谱，现代科学仪器，2000，5：9－15
[4]吕茂民，章金刚，生物质谱技术及其应用，生物技术通报，2001，4：38-41
[5]Ray Bakhtiar and Randall W. Nelson, Electrospray Ionization and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry, Biochemical Pharmacology, 2000, 59: 891-905
[6]赵晓光，薛燕，刘炳玉，MALDI-TOF质谱仪关键技术及进展，仪器评价，2003，4：17-20
[7]Kris Gevaert, Joel Vandekerckhove, Protein identification methods in proteomics, Electrophoresis, 2000, 21: 1145-1154
[8]刘晗青，郭寅龙，傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质分析中的应用，质谱学报，2003, 24(2): 363－369
[9] J. S. Page, C. D. Masselon and R. D. Smith, FTICR mass spectrometry for qualitative and quantitative bioanalyses, Current opinion in Biotechnology, 2004, 15: 3-11
[10]Kris Gevaert, Joël Vandekerckhove, Protein identification methods in proteomics, Electrophoresis, 2000, 21: 1145-1154
[11]A. Sickmann, M. Mreyen and H. E. Meyer, Identification of modified Proteins by Mass Spectrometry, IUBMB Lift, 2002, 54: 51-57
[12]蔡耘，钱小红，生物质谱技术在糖蛋白结构分析中的应用，生物技术通讯，2002，13(5)：404－407
[13]黄珍玉，于雁灵，方彩云，杨凡原，质谱鉴定磷酸化蛋白研究进展，质谱学报，2003，24(4)：494－500
[14]姜颖，徐朗莱，贺福初，质谱技术解析磷酸化蛋白质组，生物化学与生物物理进展，2003，30(3)：350－356
[15]Oda Y, Nagasu T , Chait BT, Enrichment Analysis of Phosphorylated Proteins as a Too l for Probing the Phospho proteome, Nat. Biotechnol, 2001, 19: 379-382
[16] Zhou H, Watts JD, Aebersold R, A Systematic Approach to the Analysis of Protein Phosphorylation, Nat. Biotechnol, 2001, 19: 375- 378
