用FRET研究钙离子在细胞内的分布的方法最近有新的进展：如用串联融合的兰色荧光蛋白（CFP）、CaM、肌凝蛋白轻链激酶的CaM结合肽（MLCKp）和黄色荧光蛋白（YFP）。当增加溶液中的自由钙离子浓度时，CaM结合钙离子而将 MLCKp包掩，这种空间结构变化导致了两个突变的GFP的距离接近而增强了FRET。钙离子的信号作用的开始和结束可以在细胞的内质网等特殊结构观察到。这种方法又有人加以改进进一步提高了荧光发射动力学范围（定义为最大发射速率/最小发射速率）。Kevin Truong 8等人构建了另一种钙离子指示器：YC6.1。将ckkp(CaM-dependent kinase kinase)融合于CaM的N端与C端之间起到代替CaM linker的作用。Ckkp含有一个α螺旋和发卡样Loop结构，使得与CaM的作用更加紧密。该融合体的结构为：CFP-CaM的N端片段（N-CaM）-Gly-Gly—Ckkp--Gly-Gly- CaM的C端片段YFP，使得CaM的N端C端的距离减小为40À以下，使FRET的效率显著增加。
如图5所示：
图5： YC6.1的结构示意图：a该图表示CaM（兰色）和Ckkp（橙色）结合，CaM的linker域（红色）和Ckkp的N-末端和C-末端靠近。CaM的linker域（氨基酸残基75-82）连接CaM Ca2+结合域的N-末端（N-CaM）和C-末端（C-CaM）。b Ckkp通过两个甘氨酸linker（黑色）被插入到CaM残基79和80之间，两个原来的CaM的linker（75-79）和（80-82）（红色）仍然保留在融合结构中，形成（N-CaM）-GG-Ckkp-GG-（C-CaM）融合蛋白。c 用卡通的形式表示了YC6.1的结构如何从未结合Ca2+状态变化为结合Ca2+状态的，在后一种状态两个GFP突变体的距离接近而发生了FRET。d 表示了YC6.1的基因结构。
⑺、细胞信号传导
在细胞信号传导中，蛋白质的磷酸化扮演了重要角色。蛋白激酶催化ATP的γ-磷酸转移到底物蛋白苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸的羟基上。因为磷酸基团的负电作用而使磷酸化的底物发生构象改变，进而激活了它们的催化活性，作用于下游的靶蛋白。研究蛋白磷酸化的方法有电泳、免疫组织化学以及体外蛋白激酶实验等，但这些方法不能提供足够的蛋白磷酸化和去磷酸化的时间和空间信息。象钙离子、CAMP 、CGMP、二酯酰甘油等第二信使分子已经有人用荧光检测器加以观察并达到了高分辨率的检测效果。Moritoshi Sato 13 等用基因编码的荧光指示器观察了细胞内的蛋白磷酸化现象。他们把一个感兴趣激酶的靶底物domain和一个磷酸化识别domain用一个连接序列连接形成串联融合单位（包括：底物结构域、连接序列、磷酸识别结构域）并与两边的兰色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）形成三明治式结构。两种突变GFP可分别充当受体和供体荧光素以引发FRET。底物结构域的磷酸化使之与临近的磷酸化识别结构域结合导致两个荧光素发生FRET，反过来又导致依赖磷酸化的供体和受体荧光发射速率的变化。在磷酸酶的激活作用下，磷酸化底物结构域又能去磷酸化FRET信号随之减弱。这种荧光指示器被称为’phocus’，能更好地反映细胞内激酶信号的传递。如图6所示：
图6：细胞中蛋白磷酸化的荧光指示器’phocus’示意图。’phocus’的底物结构域被激酶磷酸化，临近的磷酸化识别结构域和磷酸化的底物结构域结合，从而使CFP和YFP的距离靠近发生了FRET。
