线粒体膜电位测定
激光扫描共聚焦显微镜可辅以电位敏感性荧光染料进行间接的膜电位测量。通过测量生物膜两侧的荧光强度，代入Nernst方程即可算得该膜两侧的电位差。因为激光扫描共聚焦显微镜能有效地排除非焦平面的荧光，因而较之普通荧光显微镜能获得更为准确的膜内外荧光值，避免了可能产生的严重误差。正是激光扫描共聚焦显微镜的这一功能，被应用于细胞凋亡中一热点问题的探讨，即线粒体膜电位改变（MPT）、细胞色素C的释放与细胞凋亡的关系。
在Heiskanen等人的研究中[20]，应用了四甲基罗丹明甲酯（TMRM）来监测线粒体的膜电位。在其实验中，用staurosporine诱导单个PC-6活细胞的凋亡，同时用激光扫描共聚焦显微镜观察了细胞色素C的释放与MPT之间的时间关系。结果在用staurosporine后的2小时到7小时，线粒体膜电位发生了急剧的下降；并用绿荧光蛋白标记细胞色素C，发现线粒体膜去极化伴随细胞色素C的释放。进而，细胞色素C参加到caspase家族蛋白的激活过程中，使细胞最终走向死亡。另外，Minamikawa等[21]也对线粒体在细胞凋亡中扮演的角色进行了研究，在该实验中，Mitotracker Red被用以标记线粒体，它具有极强的光敏化作用和潜在的光毒性。当向胞内加入100nM 该荧光探针后，用激光扫描共聚焦显微镜成像，常规扫描所用的激光束在此时通过Mitotracker Red产生光毒性诱导线粒体的损伤，同时可见线粒体去极化指示剂罗丹明-123的荧光强度迅速下降，说明线粒体发生了快速去极化，而残余的少量Mitotracker Red则使线粒体在损伤后15分钟内的球状肿胀得以显现；对细胞色素C的免疫组化染色也显示在上述光照后细胞色素C由线粒体弥散到胞浆中的现象。
结语
在当今生物医学的研究中，从分析走向综合、从静态走向动态、从现象走向本质是一个大趋势。在细胞凋亡这个诱人课题的研究中，有复杂的生化级联反应，有精细交织的信号传导途径，有生物膜电位的改变以及最终形态上的大体变化，激光扫描共聚焦显微镜作为一种全新的实验手段，辅以众多荧光探针的创造性运用，的确显示出了强大的生命力。
同时，应该认识到只有选择合适的荧光探针，才能保证实验的顺利进行并获得理想的结果。因此，选择荧光探针时须考虑到：（1）现有仪器所采用的激光器，（2）荧光探针的光稳定性和光漂白性，（3）荧光的定性或定量，（4）荧光探针的特异性和毒性，（5）荧光探针适用的PH值[22]。另外，激光扫描共聚焦显微镜的有效应用尚需与其它技术联合互补，如对膜电位的定量研究中，可用微电极进行膜片钳记录或胞内记录，在测量膜电位同时测量荧光信号，以求出标准曲线[17]。
总而言之，从激光扫描共聚焦显微镜在细胞凋亡研究中应用可以展望，这项多功能、高精度、自动化的实验手段必会在将来的科学研究中发挥更加重要的作用。 （生物秀仪器频道 www.bbioo.com）
参考文献
1. Davin MS. J Cell Sci. 1989, 94(2):175-182
2. Sheppard CJR et al. Confocal Laser Scanning Microscopy. 1st edition, USA: BIOS Scientific Publishers, 1997
3. Takahashi A, Alnemli ES, Lazebink YA, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1996; 93:8395
4. McCall K et al. Science, 1998; 279:230
5. Haugland RP. Handbook of fluorsecent probes and research chemicals. 6th edition, USA: Molecular Probes Inc., 1996
6. Li R et al. J Biol Chem, 1999; 274(30): 21121
7. Cohen GM et al. J Immunol, 1994; 153:507
8. Columbaro M et al. Scanning, 1998; 20(8): 541
9. Kressel M et al. Cell Tissue Res, 1994; 278(3): 549
10. Douglas RG. Cell, 1998; 94: 695
11. Madal M et al. Biochem Biophys Res Commun, 1999; 263(3): 775
12. Sanchez I et al. Neuron, 1999; 22(3): 623
13. Trapani JA et al. Cell Death Differ, 1998; 5(6): 488
14. Beham A et al. Oncogene, 1997; 15(23): 2767
15. Ohsawa Y et al. Arch Histol Cytol, 1998; 61(5):395
16. Hiddinga HJ et al. Am J Pathol, 1999; 154(4): 1077
17. 李楠等. 激光扫描共聚焦显微术. 第1版，北京：人民军医出版社，1997
18. Jiang S et al. Exp Cell Res, 1994; 212(1): 84
19. Fang M et al.Cancer Lett, 1998; 127(1-2): 113
20. Heiskanen KM et al. J Biol Chem, 1999; 274(9): 5654
21. Minamikawa T et al. J Cell Sci, 1999; 112(pt 14): 2419
22. Huo X et al. Acta Laser Biology Sinica, 1999; 8(2):152
