PCR原理和方法: (二)
第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让 ＤＮＡ模板变性变成单链。
第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT
ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt
ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。
影响PCR特异性的因素
退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。
减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。
引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。
改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。
模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。
扩增反应可以无穷进行下去吗？
答：不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进
入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。
所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原
来以指数增加的速率变成平坦的曲线。
造成PCR进入平坡的原因有：
引物和dNTP等消耗完毕
Taq酶失活
底物过剩
非特异性扩增产物的竞争
退火时产物的单链自己缔合
变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用
（焦磷酸化，双链DNA）。
总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。
实时荧光定量PCR 的Ct值
Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。
