流式细胞术检测血小板功能及其临床应用--生物秀

　　二、全血中活化血小板的检测
　　1.血小板特异性膜糖蛋白：本法检测血小板功能，首先要对全血中的血小板进行特异性荧光标记，将血小板与血样中其他血细胞区分开来。针对血小板表面特异性膜糖蛋白制备的单抗，使血小板特异性标记成为可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究^［7］，表1显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的几种^［8］。根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板，仅给血小板做上荧光标记。

表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

膜糖蛋白	基因家族	配基	功能
GPⅠa/Ⅱa	整合素(B₁)	胶原	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素(B₁)	Fn	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素(B₁)	Laminin	粘附
GPⅡb/Ⅲa	整合素(B₃)	Fb,vWF,Vn,Fn	聚集
Vn受体	整合素(B₃)	Vn,?vWF,?Fn	粘附
GPⅠb/Ⅸ	LRG	vWF，凝血酶	粘附
GPV	LRG	?	凝血酶底物
GPIV		Thrombospodin	粘附
GP53			血小板-粒细胞
GMP140	选择素		相互作用

　　注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族

　　2.活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。
　　全血法流式细胞术也是一种免疫学方法，活化血小板表面能通过免疫方法检测的标志物可分为三类^［9］：第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位^［10］，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高^［9］；GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低^［7］。它们都是活化血小板的分子标志。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
　　除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca²⁺浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca²⁺流^［10］，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能^［11］等。
　　3.单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。

表2　活化血小板CD单抗简介

CD单抗	代表性单抗	识别的膜糖蛋白
CD36	5F1，CIMeg1，ESIVC7	GPIV
CD41	PAC1，7E3，PBM6.4	GPⅡb/Ⅲa和GPⅡb
CD42a	FMC25，BL-H6，GR-P	GPⅠ
CD42b	PHN89，AN51，GN287	GPⅠ
CD61	Y215，CLB-thromb/1	GPⅢa
CD62	CLB-thromb/6,RUU-SP1.18.1	P-selectin或GMP140
CD63	RUU-SP2.28，CLB-gran/12	GP53