Rotor-Gene是一套实时显示DNA扩增和杂交过程的循环变温系统。该装置能在其36孔转轮上容纳36个0.2 ml的标准离心管。72孔的转头还能装上一种特殊的四联管,这种0.1 ml的小管4个连在一起。整个反应过程中,转头都以500转/分钟的速度保持离心旋转。
注意:转头旋转时要装满管子,不管是72孔还是36孔的转头。如果样品管数不够,将空管填满转头,这将保证在旋转时每管受热的均一性,保证实验结果准确性。
Rotor-Gene有4个不同波长的LED激发光源,以及有4个检测通道:通道1用于510 nm检测,通道2用于550 nm检测,通道3用于585 nm检测,通道4用于625 nm检测从而允许四种不同样品被同时激发检测。当样品管转到检测通道时,高能量的LED发出激光激发样品,PMT检测器收集信号。
主体内容:
1. 软件打开以后自动弹出 “New Run”窗口。选择了合适的程序以后,按<New>键。
主要参考文献:
2. 选择所用的转子类型:36孔或72孔,并确认没有使用圆盖的PCR管。然后单击<Next>进入下一步。
3. 填入操作者的名称以及反应的备注信息(这两项可不填),并键入反应体积。按<Next>进入下一步骤。
4. 选择“Edit Profile”进入程序设置。
4.1在“Edit Profile”窗口中,通过<Insert after…>,<Insert before…>,<Remove>键增加或删除反应步骤。要更改每个步骤的内容,则先选定该步骤,再对各步骤的温度,时间设置进行更改。
Insert before:允许在选定的项目之前插入一个步骤,比如在循环体之前加入一个保温过程
Insert after:允许在选定的项目之后插入一个步骤,比如加入一个熔解曲线
Remove:从列表中去除不要的步骤
Denature:设置变性温度和时间
Cycling:设置循环体
Melt:设置起止温度及每一个温度的持续时间
在设置“Cycling”内容时,窗口如下;该步除对反应时间,温度进行设置,还需要设定在哪步读取荧光,单击“Acquiring to Cycling A” 或“Not Acquiring”按钮会弹出“Acquisition”对话框,用[<],[>] 和 [<<] 键在两个窗口中移动通道,所有列在右边的通道都是机器运行时时要采集信号的通道。按<OK> 键确认结束对话。如果在这个循环步骤不采集荧光,则点击Don't Acquire键。通过<+>,<—> 按钮可以增加或减少Cycling中的步骤,每个Cycling最多可设置5步。点击“OK”回到上一界面。
4.2 <Calibrate…>功能允许设置每一通道的灵敏度。设定反应需要采集荧光的温度,选择在哪一步运行校正程序,然后选择需要校正的通道,按<Start>键,仪器自动进行校正,完成后按<Close>结束对话。
5. 按<Next>键进入下一步骤,确认了反应设置后,按<Start Run>开始反应。
6.此时会弹出文件保存<Save as>窗口,该文件包括一次运行的所有信息。
7.选定保存后,自动弹出样品编辑窗口。该操作窗口用于定义放入转轮内的样品。转轮上的数字对应于操作窗口中的样品号。
有以下几种样品类型:
None:该位置无样品。
NTC:阴性对照。
Sample:待测样品。
Standard:标准样品(已知浓度)。
known Conc:每个标准品的浓度,可以是10进制原始数据,也可以是对数值。
完全的样品描述可以存储成样品文件,便于以后类似文件的设置。
每一样品可以选用不同的颜色代表。
该窗口的设置可以在整个反应过程中,以及反应完成后进行调整更改。通过依次点击〈View〉〈sample〉进入该窗口,或是通过右击窗口右边的样品栏可以进入。
8.程序运行后,可以在软件界面上实时观察到如下的窗口:
分别显示原始的荧光信号收集界面,温度界面和反应进程界面,窗口右边是样品信息栏。通过此界面可以实时检测PCR反应,知道反应剩余时间,以及升降温情况。
样品信息栏中:
<Bank On>显示目前列表中所有8个样品
<Bank Off>不显示目前列表中所有8个样品
<Name on>显示所有命名的样品
<All on >显示所有36或72个样品
<All off>不显示所有36或72个样品
图表窗口中:
<Adjust>允许手动调整最大最小值
<Auto Scale>自动调整图表数值范围
<Default Scale>回复到默认值(0-100单位)
9.反应完成后,单击“Analysis”菜单,弹出“Analysis”窗口。选择所需要的分析方法,
如:定量分析,熔解曲线分析等之后,按<Show>键,则可以在窗口中看到相关图表结果。
10.对结果进行分析以后,选择“Report”菜单,可以得到分析结果的报告。通过<Print>,<Save as>,<email> 等按钮可以打印,保存和把报告发到电子邮箱中,也可以把报告以Word的形式输出,此时只需要选择<to word>按钮即可。

