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PFGE(脉冲场凝胶电泳)标准操作规程(SOP)
作者:未知 来源:国家CDC科室培训资料 时间:2007-7-15

    图像的输出
    1、保存图像(*.1sc):FILE→SAVE。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。
    2、打印文件:FILE→PRINT→VIDEO PRINT,也可以直接点击屏幕上的PRINT按钮。
    3、转为*.TIFF格式:FILE→EXPORT TO TIFF IMAGE→EXPORT,选择正确的路径。
    4、关闭QUANTITY ONE程序:FILE→EXIT。
    5、取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体,用水或70%的异丙醇洗干净。
    试剂储存液的配制
    1、1 M TrisHCl, pH 8.0*
    121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中,加入80 ml 6 N HCl*,在室温下调pH至8.0,加水终体积至1000 ml,高压灭菌。
    或者157.6 g Tris-HCl溶于800 ml纯水中,在室温下调pH至8.0,加水终体积至1000 ml,高压灭菌。
    2、10 N NaOH*
    400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中,冷却到室温,加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。
    3、0.5 M EDTA, pH 8.0*
    186.1 g Na2EDTA2H2O溶于800 ml纯水中,加入50ml 10N NaOH调pH至8.0,加水终体积至1000 ml,分成数份,高压灭菌。
    4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)*十二烷基硫酸钠-用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, PFGE
    将20克SDS小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中,在35°- 45℃轻轻混匀溶解,定容至100ml。
    5、20 mg/ml 蛋白酶K储存液*
    100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中,混匀,分装在1.5 ml离心管中,每管500-600 μl,-20℃保存备用。
    6、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE), pH 8.3*
    0.9 M Tris base (108 g)
    0.9 M Boric Acid (55 g)
    0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M)
    溶于1000 ml灭菌的纯水中,高压灭菌
    注意:如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。
    7、Ethidium Bromide(EB)*
    10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 μl储存液),(500ml水中加50ul)。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。

    实验试剂

    注意:用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。
    1、Tris:EDTA Buffer (TE), pH 8.0*-(10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.0)
    10 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.0
    2 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
    用灭菌的纯水稀释到1000 ml
    在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE -用TE Buffer 于:
    ⑴. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose
    ⑵. 细菌裂解后洗胶块
    在L. monocytogenes PFGE -用TE Buffer于:
    ⑴.悬浮菌细胞
    ⑵. 细菌裂解后洗胶块
    2、Cell Suspension Buffer (CS-100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0
    用于E. coli O157:H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE
    10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
    20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
    用灭菌的纯水稀释到100 ml
    3、Cell Lysis Buffer(CLB)-50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl),0.1mg/ml Proteinase K (用前再加入)
    用于裂解E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobacter jejuni
    25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
    50 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
    50 ml 10% Sarcosyl 3
    用灭菌的纯水稀释到500 ml,每5 ml CLB加入25μl蛋白酶K储存液(20 mg/ml),使其终浓度为0.1 mg/ml.
    5、0.5X TBE Buffer
    200 ml 5X TBE用纯水稀释到2000 ml或
    100 ml 10X TBE用纯水稀释到2000 ml
    注意:用来稀释5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌。

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