四、胶块内DNA的酶切
1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。
2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。
试剂µl/胶块µl /10胶块
纯水180µl1800µl
Buffer D20µl200µl
总体积200µl2000µl
注意：缓冲液要置于冰上。
3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。
4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。
5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。
6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。
7、将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。
8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。
试剂µl/胶块µl /10胶块
纯水175µl1750µl
Buffer D20µl200µl
酶(10U/µl)5µl50µl
总体积200µl2000µl
注意：
(1)将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。
(2)用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。
9、每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。
10、在37℃水浴中孵育至少2小时。
五、加样
(一)将胶块直接粘在梳子齿上
1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使
其水平。
2、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
4、每管加入200µl 0.5×TBE。
5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳
子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。
6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。
7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面
相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
8、记录加样顺序。
(二)将胶块直接加在加样孔内
1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶
槽使其水平。
2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃－60℃平
衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
3、小心拔出梳子。
4、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
6、每块胶加入200µl 0.5×TBE平衡。
7、用小铲将胶块加入加样孔。
8、用溶化的胶封闭加样孔。
