刘向国 谢国明 (重庆医科大 重庆市 400016)
摘 要 荧光定量PCR仪技术是一种新的核酸定量技术，该技木在PCR仪反应系统中引人了荧光标记探针，具有可实时监测，高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，极大地克服了原有PCR仪技术的不足，扩大了PCR仪的应用范围。
关键词 定量PCR；荧光；基因
Flu0rescence quantitative PCR and its application to m edicine
LIU Xiang-guo，XIE Guo-ming
(Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 40001 6)
Abstract Fluorescence probe is cited in the PCR instrument mentioned in this paper． As a new kind of nucleogen technology， fluorescence quantitative PCR has such exeellences as high sensibility，specificity and accuracy．W ith the application of the new technology，the deficiencies of the traditional one are conquered and the application field of the instru ment is extended．
Keywords quantitative PCR；fluorescence；gene
1 概述
荧光定量多聚酶链式反应是一种新的核酸定量技术。该技术将荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)应用于常规多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪中，从而进行定量检测。FRET即是通过受体发色团之间偶极一偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，转移效率与曲个发色团之间距离的6次幂倒数成比例。与普通定量PCR相比，荧光定量PCR仪具有可实时监测、准确性高、效率高等优点，本文综述目前国内外几种荧光定量PCR仪技术及应用。
2 荧光定量PCR 方法
2．1 TagMan
TagMan技术是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能够裂解双链DNA5 端核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置换了的具有又样结构的单链DNA，水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Tag酶的这种活性，设汁合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5 端标记一个荧光分子．3 端标记另一个荧光分子。其中3 端荧光分子能够吸收5 端荧光分子发出的荧光，因此，正常情况下该探针检测不到3 端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR 产物(模板)时，该针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Tag酶5 外切酶活性，将探针5 端连接的荧光分子从探
针上切割下来，破坏了两荧光分子间的FRET，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的量。其主要不足是：
2．2 Molecular beacon
分子信标技术(molecular beacon)也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与Tag Man探针不同的是，该探针5 和3 末端自向形成8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构，于是溶液便产生了荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低 其不足之处是：(1)杂交时探针不能完全与模板结合，稳定性差；(2)探针合成时标记较复杂
近来，基于Molecular beacon的原理，人们对其进行改进，使用了一种发卡式引物(sunrise primer)．此法能将所有扩增产物均标记上荧光分子，因此荧光信号响应快。但无法区分特异和非特异扩增是致命不足 为了克服不足，人们义对其进行改进，发明了一种称为蝎状引物(scorpion primer)的荧光定馈PCR技术。该技术在引物与Molecular beacon探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至Molecular beacon分了 这样，非特异扩增产物便无荧光信号，但当有物异扩增产物时， 即可与Molecular beacon进行分了内杂交， 产生荧光信号既解决了非特异问题，又保留了响应快的特点。但仍存在杂交时， 探针不能完全与模板匹配及合成复杂的问题.
2．3 Amplisensor
Amplisensor是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一种淬灭物。 探针长度不同，其中淬灭物标记探针5 端多出7个碱基(GCGTCCC)。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5 应有一段与长探针互补的序列． 以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针一引物复合物作为半套式引物掺入模板，从而释放淬灭探针部分，破坏了荧光能量传递，产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法主要特点：(1)采用半套式PCR扩增，提高了灵敏度，但无法区分引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，使定量准确度受到影响；(2)每次PCR扩增前，要先进行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本；(3)中间需加入半套式引物，增加了污染机会。
2．4 Lightcycler
Lightcycler是新近发展起来的一种定量PCR技术，该技术将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，形成发光探针和淬灭探针，发光探针的5 端与淬灭探针的3 端分别连接荧光分子。两探针设计为可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此进行定量分析。该方法淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上，因此影响扩增效率。此外，由于需合成两个较长探针，合成成本较高。
