如果是DNA类的样品,其制备过程大致也是:首先将根据实验目的,稀释原液;然后取适量稀释液滴加于新鲜裂解云母表面, 氮气展平, 吹干。固定好的样品置于AFM的扫描器上,即可进行生物大分子表面形态结构的成像观测。
目前,AFM 已广泛应用于对生理生化反应中蛋白质、核酸等生物大分子的形态或功能的动态研究上。在此基础上还可以进行分子水平的热力学和动力学的研究。研究生物大分子的生理生化过程,是目前AFM 在生命科学中应用最多的领域之一。配备了环境气氛箱的AFM 可以在样品箱内进行气氛控制,样品调整以及样品观察。这样可以对生物大分子在各种不同的气氛(包括大气、低真空、各种气体置换、湿度、温度等条件)下的形态结构等进行研究。在这个领域里研究较多的主要有:蛋白的聚合 、纤维组装的过程[12]、胶原的超微结构和组装、蛋白三维晶体增长的研究 、生物膜的结构和生物物理特性的变化[13] 、DNA的装配过程以及生物大分子之间的交互作用[14] 等。
五、原子力显微镜对生物分子之间力谱曲线的观测
用AFM 对生物大分子进行形态结构观察的同时,还可对大分子的其他性质进行研究。如配体-受体之间作用力[15],抗原﹣抗体之间的作用力[16]等。生物分子表面的各种相互作用力进行测量,是原子力显微镜的一个十分重要的功能。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的。因为这种作用力决定两种分子的相互吸引或者排斥,接近或者离开,化学键的形成或者断裂,生物分子立体构像的维持或者改变等等。在分子间作用力的支配下,还同时支配着生物体内的各种生理现象、生化现象、药物药理现象,以及离子通道的开放或关闭,受体与配体的结合或去结合,酶功能的激活或抑制等等。因此,生物分子间作用力的研究,在某种意义上说,就是对生命体功能活动中最根本原理的研究。这也为人们理解生命原理,提供了一个新的研究手段和工具[17]。
将两种分子分别固定于AFM的基底和探针尖端上。然后使带有一种分子的探针尖端在垂直方向上不断地接近和离开基底上的另一种分子。这时, 两种分子间的相互作用力,就是二者间的相对距离的函数。这种力与距离间的函数关系曲线, 我们称之为力谱曲线。
对于作用力的测定, AFM 对生物医学样品制备,同样也有一定的要求和具备一定的
特点:即需要将研究的两种分子分别固定于基底和探针尖端表面,而且还要求固定相对牢固。因此,样品制备的难度比其他的要大的多。例如,利用AFM 来测定配体-受体之间作用力的样品制备为例子,其过程大致如下:
配体必须固定于AFM 尖端。我们用链抗生物素对尖端进行功能化处理。将AFM 悬臂浸入乙酮 5 分钟,然后紫外线照射 15 分钟;在37 °C的湿润孵化器中,悬臂浸入一滴50 ml 生物素-BSA(牛血清白蛋),孵育过夜;用PBS 磷酸缓冲液(pH 7.4)洗三次,除去非结合蛋白;室温下悬臂浸入一滴50 ml 链抗生物素中,孵育 10 分钟,在碱性环境中,使BSA吸附于悬臂;悬臂使用前,用PBS再冲洗三次即可。总之,将特定的配体或者受体固定于悬臂探针表面,将与之对应的受体或者配体固定于基底表面。在悬臂探针表面与基底表面相接近或者分离的过程中,悬臂受到偏折,从而测得两个功能化表面之间的作用力。即配体-受体之间的作用力。
通过对AFM探针进行功能化修饰,使针尖的表面带有特殊的官能团,用以识别存在于同一表面内的不同官能团,进行表面组份成像。它可以实现纳米范围内化学反应特性的研究。 AFM还可以实现同时对生物分子表面结构、作用力等的动态实时观测。如生物大分子的弹力、细胞壁的膨胀压力以及各种微粒之间的各种相互作用力等。近年来,在AFM基础上各种扫描力显微术发展很快,主要有静电力、摩擦力、磁力、剪切力等显微术。力对样品的表面性质很敏感,根据检测力的变化可以获得样品表面丰富的信息。
六、结 论
AFM独特的成像方式和具有nm水平的分辨率,使的它在众多科学领域中得到迅速的发展和应用。例如金属,半导体材料、微电子、纳米材料、计算机材料[18]、物理、化学、生物、生命科学等。总体上来说,国内目前在此方面的研究,主要集中在中科院系统的少数科研单位,并以材料学研究为主。而原子力显微镜在生物医学中的应用,还处在比较初级水平的阶段。尤其在我国,在生物医学系统,拥有电子显微镜的部门很多,约一千台数左右。然而拥有原子力显微镜的部门却很少,约少数几个单位的一、二十台数左右。少数拥有原子力显微镜的部门或单位,所开展的研究工作,也都比较初步,大都停留在一般细胞的表面形态观测上。发表在第四届到第六届全国STM(扫描隧道显微镜,是AFM的前身,统属SPM扫描探针显微镜)学术会议(1996年到2000年)上,有关生物医学的文章,总共约20篇左右。

