为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)

方法1:  只使用转染细胞检测

方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.

方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.

方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4^＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时

方法5: CD4⁺ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days

方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)

方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激

方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.

方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时

方法10: CD4^＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。

方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时

方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时

 六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时

2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色

① 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/10⁶细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断

3、细胞表面染色

① 加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×10⁶/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；

② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

③离心500g 5分钟，弃上清

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页