全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。

组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×10⁶细胞/ml。

细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×10⁶细胞/mL于新鲜培养基中。

冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

四、所需试剂

1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂

依据实验需要选择特殊表面标志

CD45圈定所有淋巴细胞
CD3 圈定T淋巴细胞
CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群

CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
CD19/或CD20圈定B淋巴细胞
CD56圈定NK淋巴细胞
CD14圈定单核细胞

2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体

3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞

4、激活剂

①      Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）

A. DMSO中调节浓度0.1mg/mL

B. 分装(20L)，－20℃储存。勿反复冻融

C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液

D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液

②      Ionomycin  （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）

A.       于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL

B.       －20℃储存

C.      每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液

D.      Ionomycin终浓度1g/mL细胞悬液

③      Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)

A.     无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL

B.     4℃储存

C.    SEB终浓度10g/mL细胞悬液

④      CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞

⑤      CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml

5、阻断剂

阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内

① Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）

A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
B. 分装(20L)，-20℃储存。勿反复冻融。
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
D. 激活最后4－5小时BFA终浓度10g/mL细胞悬液。

注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目录号00-4505）

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