DNA 片段序列分析的策略
1．Primer walking
引物依次推进法是从目的片段的一端开始，利用载体上的序列为依据，设计第一次反应的反应引物进行测序，然后，依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。引物依次推进法需要多次设计和合成引物，比较繁琐；对于重复序列较多的目的 DNA ，由于引物的非特异性结合概率高，所以该方法不适合于测定含有多重复序列的 DNA 片段。
2．随机测序（random approach），或称作鸟枪法（shotgun strategy）
原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化（DNA 片断化的手段通常有超声波处理和酶切），得到两端彼此重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。原理图示如6-5：
3．定向测序
定向测序的基本策略是沿着目的 DNA 的同一个方向逐渐向前推进，直至目的 DNA 的另一端。可采用嵌套缺失法或引物依次推进法。
嵌套缺失法是利用缺失随机突变原理，先将目的 DNA 克隆到载体上，再用限制性内切酶在邻近其一端处切断载体，使之变成 3' 端凹进 5' 端突出的线状 DNA ，再用外切酶（exonuclease Ⅲ）或者 DNaseⅠ 加 Mn++ 离子，沿此末端逐步消化目的 DNA ，（只能从 5' 突出端开始消化，而不能从 3' 突出端开始消化，这是由酶的特性所决定的）（详见后文）。于是只要控制消化时间，即可得到一组依次相差若干碱基，其一端固定于载体另一端游离的目的 DNA 片断，再经末端修饰，重新连接，即可得到一群一端相同但长度不等的目的 DNA 克隆。之后，用同一引物从缺失端开始测序，最后，排列和比较所有子片断的序列，即能得到目的 DNA 的全部序列。 |
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