前些时候做分子生物学实验时老师给我们的实验讲义，整整做了一天，不过最后电泳时没有看到结果，可能是提取时RNA被降解了吧，第一步EP管中就没看到RNA沉淀。
分子生物学实验指南
植物材料
携带蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus 2, BBWV-2）的蚕豆植株（采自湖北省境内）
材料、耗材与试剂
研钵、移液器
1.5 mL 离心管、兰色、黄色和白色吸头；
液氮；
琼脂糖、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）、上样缓冲液(6×)、DNA分子标记、电泳缓冲液（见配方）；
M-MLV 逆转录酶、RNA 酶抑制剂（Rnasin）、dNTPs、正反向引物；
含镁离子的Taq DNA 聚合酶；
氯仿、苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、无水酒精、75%酒精。
电泳缓冲液配方
实验1 RNA 的抽提
方案
从感染BBWV-2 的蚕豆叶片提取总RNA，方法参照公司TRIZOL 试剂盒说明，具体步骤如下：
a 取0.1g 叶片，加液氮研磨成粉状
b 加1mL TRIZOL，室温放置5min
c 加200μL 氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min
d 12，000rpm 4℃ 离心15min
e 取上清液，加500μL 异丙醇，混匀
f 12，000rpm 4℃离心10min
g 75％乙醇洗涤沉淀，真空干燥
h 加30～50μL DEPC 处理的纯水，-70℃保存备用
实验2 cDNA第一链的合成
合成引物
根据已报道的序列合成一对引物。利用该对引物扩增位于小外壳蛋白（coat protein, CP） 基因内的片段，大小为450bp。
方案
取2μL(约1μg)总RNA，加1μL (5pmol) 反向引物、4μL 5×逆转录酶缓冲液、0.8μL Rnasin、1μL dNTPs，1μL (15U) M-MLV 逆转录酶，加足 DEPC 处理的去离子水至总体积为20μL，37℃水浴60min， -20℃保存备用。
实验3 PCR 扩增
方案
取0.5μL 反转录产物为模板进行PCR 扩增。扩增体系为：2.5μL 10×PCR 缓冲液(含MgCl2)，1μL dNTPs，5′端和3′端引物各0.2μL （1pmol），0.5μL (1.25U) Taq DNA 聚合酶，补去离子水至反应总体积25μL。
扩增条件为：94℃预变性3min 后，94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸45s，共36 个循环，72℃延伸5min。
实验4 琼脂糖凝胶电泳
方案
1、1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。）；
2、用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固；
3、充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子；
4、用移液器吸取DNA样品10μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔；
5、打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min；
6、将凝胶放入EB染液中染色5-10min，用清水稍微漂洗；
7、将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。
