袁改玲1，郭媛华2，张俊英3, 才学鹏1*
（1．中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046；2．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特 010018；3．河南省平顶山市畜牧局，河南平顶山 467000）
摘 要： 随着噬菌体展示技术自身建库、筛选方法等方面的进一步改进和完善，目前已被广泛应用于生命科学的许多领域，特别是噬菌体表面展示技术在蛋白质相互作用方面的成功应用，为筛选新的结合蛋白提供了一种简单、有效的手段，还为功能基因组学的研究提供了一个新的方法。该技术还在药物研制和疾病机理方面显示出很大的应用潜力，目前已成为筛选对人类疾病有诊断和治疗价值的生物活性分子的重要手段，并已广泛用于癌症、艾滋病、心血管病、组织器官移植、神经性疾病等领域药物的研究和开发。
关键词： 噬菌体展示技术；蛋白质相互作用；新药研制；疾病机理
噬菌体展示技术（phage display techniques,PDT）是以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术[1]。由于噬菌体展示技术的基本原理多年来没有突破性的进展，为了拓宽噬菌体展示技术的应用范围，满足人们的各种需要，外源基因表达的载体从M13噬菌体拓展到了λ噬菌体、酵母和细菌，所插入的外源基因片段也从小肽基因扩展到了抗体片段基因、蛋白质基因和cDNA文库等[2]。这些改进使得噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。
1 与蛋白质相互作用的研究
蛋白质组学（proteomics）是研究参与特定生理或病理状态下的所有蛋白质种类及其与周围分子的关系。其研究特点是蛋白质种类众多且量微。蛋白质的结构决定蛋白质的功能，而蛋白质功能的发挥在很大程度上依赖于蛋白质之间的相互作用，蛋白质之间的相互作用及识别是通过局部肽片段间的相互作用实现的。而这些需要高通量和高灵敏度的研究工具。
自1985年Smith G P等[3] 创建噬菌体展示技术以来，因其在筛选新的蛋白质时更为简单，流通量大，目前已成为后基因组时代研究蛋白质相互作用的一个强有力的工具[4]。以往的噬菌体展示技术多以M13为载体，M13虽在小分子展示方面取得了较大的成功，但它不能用于展示结构复杂的蛋白质[5]。最近，由Navagen公司构建的T7噬菌体cDNA表达文库，进一步扩大了噬菌体展示技术的应用范围。T7噬菌体载体是将外源基因序列插入到编码T7噬菌体包膜蛋白基因中，插入片段基因长度可在300 bp ～3 000 bp之间，所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体包膜蛋白融合的形式展示在噬菌体表面，大小在50个～1 200个氨基酸。T7噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白的一定构象。因此，该系统最大程度地再现了细胞内的真实情况，所筛选出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前已被成功应用于蛋白质-蛋白质、抗原-抗体以及DNA-蛋白质之间作用的研究，为功能基因组学的研究提供了一种新的方法。
信号转导过程中存在着复杂的蛋白蛋白之间、蛋白与接头之间的相互结合与相互作用。李志杰等[6]利用T7噬菌体展示筛选系统，以丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路中p38作为靶蛋白，筛选了与其有结合关系的多肽或蛋白，得到了46个编码蛋白的序列，在这些蛋白中有激酶、转录因子、细胞骨架相关蛋白和离子通道相关蛋白等。此外，T淋巴细胞活化以后，酪氨酸残基的磷酸化修饰过程是通过一些蛋白复合物进行的，包括酪氨酸激酶、磷酸酶以及一系列的接头蛋白如Grb2等。为了鉴定是否还存在其他与此激活过程有关的蛋白分子，应用噬菌体表面展示技术进行了筛选，结果发现淋巴细胞特异性酪氨酸磷酸酶与之有关。
cDNA库是在噬菌体上插入从某些组织或细胞中抽提出来的mRNA的互补DNA片段，取代在细胞内表达cDNA的文库，Zucconi A等[7] 将人脑cDNA片段插入λ噬菌体或T7噬菌体编码衣壳蛋白的基因上，筛选到了与synaptojanin(一种在胞吞作用中起作用的肌醇5磷酸酶)富含脯氨酸的羟基端结合的蛋白质，分析了50个克隆，得到7个作用蛋白，其中4个已证实与synaptojanin的结合具有生理作用。
应用噬菌体表达型cDNA文库的筛选，对于诱导帕金森病的毒素N甲基化β苯酚的结合蛋白进行了研究。抑制这种毒素在诱导帕金森病中具有十分重要的作用，但是一直不清楚它在细胞内作用的蛋白是什么。利用T7噬菌体cDNA表达文库筛选到了与这一小分子结合的脑蛋白。筛选得到的6个蛋白与帕金森病的发病有关，如α微管蛋白、副氧络酶、脂肪酸结合蛋白、血小板激活因子乙酰羟化酶等。这一研究结果启发了我们研究帕金森病发病机制的新思路，同时对于非蛋白作用靶蛋白的研究方法选择也具有十分重要的提示作用。
