目的基因克隆

目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。

这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基因很少，成功克隆出基因很困难。因此我们选择在CDS两端设计高效价引物，先将基因从cDNA文库中克隆，将克隆插入T载体中。之后再设计一对用于精确克隆的引物，以插入目的基因的重组T载体为模板，克隆出用于表达的基因，插入T载体。GS目的基因的拷贝数很高，及时引物效价不高，仍然能获得GE。

全长基因难以获得时(如GC含量较高)，可克隆目的基因中800～1000bp的片段用于表达。

1．  细胞复苏及培养

a．  确定细胞复苏用得培养液。培养液使用前37C水浴温育。

b．  预先准备10ml的相应培养液，用于洗涤复苏细胞

c．  从液氮中取出cell后，37C温育至融化。开盖前用酒精消毒

d．  用移液管将复苏细胞转入step b中的培养液中洗涤，除去冻存cell中的DMSO

e．  1000rpm，5min，去上清，轻轻振荡重悬cell，加入1ml左右新培养液，混匀

f．   转移cell至含20ml左右培养液的培养瓶中，盖口不能拧紧，37C培养至培养瓶壁贴满cell

g．  培养约2－3天至细胞贴满培养瓶壁时将细胞传代，分装两个培养瓶，一个保种，一个抽RNA。

2．  RNA抽提

悬浮细胞            组织器官                   单层贴壁细胞

（5-10X10⁶）        (50-100mg)                     10⁷

1000rpm，5min离心       匀浆           胰酶消化至细胞悬浮，1000rpm，5min离心

                     PBS洗涤两次(PBS无须DEPC处理)，

1mlTRI REAGENT 裂解，用枪吹打混匀，室温5min

                    可-20度保存留用，or

200ul 氯仿（剧烈摇匀vortex，室温5min,ice 5 min）

12000g 15min 4℃

    取水相（500ul以上）加入等体积异丙醇(室温5min,ice 5min)

加完异丙醇立即上下颠倒5－10次混匀，若同时抽多管，则每次加完一管后都应立即混匀

 12000g 15min 4℃

                    倾倒除去上清，并用枪吸干

1ml 75%乙醇 wash一次，用枪吹打均匀

7500g， 5 min  4℃

去上清，尽量用枪吸尽

air dry the RNA pellet ,2～3min

do not let RNA turn translucent

50 ul ddH₂O (DEPC treated) dissolve by a pipet

检测O.D值/1% agsrose 电泳

   RNA分装成10ul后冻存，防止反复冻融使RNA降解。取RNA时一定带上手套，避免手上的RNA酶污染。

  抽提RNA后应跑核酸电泳检测RNA纯度及降解程度。一般RNA抽提后应在700bp～1.5kb范围内有两条清晰的带。

3．  Reverse Transcription

System（40ul）

      5X buffer                  8ul

      0.1M DTT                 4ul

      dNTPs(10mM)             8ul

      RNAse inhibitor             0.5ul

      Superscriptase                1ul

      Oligo（dT）_12-16 (0.5ug/ul) 1 ul

Sample RNA (4ug)        4ug

      DEPC H₂O                 add to 40ul

将Oligo dT与RNA，DEPC水混匀后，70C水浴10min(封口)，冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37C水浴1.5h，95C水浴5min(封口)，冰浴，-20C store。RT-PCR水浴时封口膜封EP管，防止水蒸发影响反应体系。

RT-PCR后用持家基因HPRT引物PCR，检测RNA抽提质量。HPRT退火温度60C左右。HPRT长度较小，为与引物二聚体区别，PCR时需做一不加模板的空白对照

取DEPC水时切记带上手套

Genequant使用方法：

开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品

1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）。

2．加80ul水测对照

3．2ul RNA稀释40倍测浓度

4．测完后看RNA浓度（conc键），ratio值（ratio键）

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