1. 动物组织RNA的提取

实验目的：掌握由动物组织中提取总RNA的方法

实验原理：Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA.

实验步骤：

 ① 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

 ② 室温放置5min，然后加入200µl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。

 ④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。重复操作一次。

 ⑤ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µl DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

   另外，还可以通过试剂盒提取总RNA， 操作步骤见试剂盒说明。

2. RT-PCR扩增目的基因及琼脂糖电泳分析

实验目的：掌握通过RT-PCR方法由真核生物的总RNA中获得目的基因的方法，并通过琼脂糖电泳对扩增结果进行定性检测。

实验原理：由于真核生物的mRNA的3′端存在 Poly(A)尾，这样以olig（dT）为引物，在逆转录酶的催化下，就可以合成互补DNA（cDNA），然后以cDNA为模板，利用目的基因扩增引物进行PCR就可以扩增出目的基因。

实验步骤：

RNA的反转录

 ① 在小EP管中依次加入

       RNA模板                 3 μl

       Olig（dT）₁₈引物          1μL

       DEPC H₂O                8 μL

   混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），再冰浴5min。

 ② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL)：

       RT 5×buffer             4μL

       RNasin             1μL

       dNTP ( 10mM)           2μL

    混匀，37℃ 5min。

       M-MULV反转录酶      1 μL

    置于 42℃水浴，1h。

 ③ 70℃保温5min（使酶失活）。

 ④ 于-20℃保存备用。

PCR扩增目的基因

   以反转录产物为模板，克隆引物B1，B2为引物，利用rTaq酶进行扩增目的基因，用于后续连入克隆载体的操作，然后再以表达引物EB1，EB2为引物，利用Pfu DNA聚合酶进行扩增目的基因，用于后续连入表达载体的操作。

                     94 ℃         3 min 
 

                        94 ℃         45Sec

         30 cycles:       57 ℃         45Sec

                        72 ℃         45Sec

                        72 ℃         5min

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