黄璐琦 王敏 周长征* 李念华** 何希荣 杨滨
（中国中医研究院中药研究所生药室，北京 100700；*北京中医药大学中药学院 药用植物教研室，北京 100029；**中国科学院植物研究所，北京 100044）
摘要 以细辛类药材的鉴别为例，对RAPD方法在药材鉴别中所存在的问题探讨，结果表明药材DNA模板浓度，降解程度及药材的产地均对PAPD产物有不同程度的影响，从而提出选择适宜的药材DNA模板浓度，筛选合适的引物采用对照组聚类分析等方法来消除上述因素的影响，进而讨论了PAPD方法在药材鉴别上的适用范围。
关键词 多态性分析； 细辛类药材
90年代在polymerase chain reaction (PCR)技术基础上发展起来的随机扩增的DNA多态性分析(random amplofied polymorphic DNAs, 简称PAPD)已成功地应用于遗传多样性的检测、基因定位和品质鉴定等诸多领域，并已开始用于人参、西洋参、蛇类、地胆草等中药材的鉴定[1]。这一方法快速、简便且灵敏度高，但其应用于遗传多样性和系统学研究中所存在的问题，如DNA模板纯度、浓度及RNA对扩增产物的影响，已引起关注和研究[2]。在药材鉴别方面，还存在如何克服DNA模板降解程度不一对扩增产物的影响，1~2个引物鉴别药材的可靠性，以及RAPD的适用范围、合适引物的筛选等诸多特殊问题。本文以细辛类药材的鉴别为例，针对这些问题，设计了一组实验来进行探讨。
材料和方法
仪器和试剂 1169型电脑全自动基因扩增仪（北京市新技术应用研究所）；Micro-MB3616型高速离心机（IEC公司，美国）；UV-Ⅰ型多功能紫外透射仪（北京市新技术应用研究所）。
Tap酶(U-P Biotech, Inc, USA)；琼脂糖(Promega公司)；dNTPs(Promega 公司)； CTAB(Sigma 公司)；溴化乙锭(Fluka 公司)；其余试剂为北京化工厂产的分析纯。
材料 细辛类药材和艾叶药材取自中国中医研究院中药研究所标本室；原植物取自中国科学院香山植物园。除艾叶药材由李燕立鉴定外，其余都经杨春澍教授鉴定。材料情况见表1。DNA模板的提取和浓度测定 干药材0.10g或新鲜叶片少许，置1.5ml EP管中，加入液氮用镊子研碎，立即加入500цl保温60℃的2X CTAB提取液[CTAB 2%，Tris-HCI(PH 8.0)100 mmol·L-1,EDTA 20 mmol·L-1 ,NaCI1.4 mmol·L-1，巯基乙醇2%]及20цl巯基乙醇混匀，60度保温40 min；加入等体积的氯仿一异丙醇（24：1）抽提，轻轻颠倒混匀，10000 r.min-1离心10 min，吸取上清液，加入1/10体积的10% CTAB溶液，再加入等体积氯仿一异两醇（24：1）重复抽提一次，吸取上清液加入等体积的沉淀缓冲液[CTAB 1%，Tris-HCL(pH8.0)50 mmol·L-1,EDTA 10 mmol·L-1,巯基乙醇1%]，室温下放置30 min以上，10000 r.min-1离心10 min，小心去上清液，分别用79%乙醇和无水乙醇各洗涤一次，弃掉洗液、挥干。用分光光度计测定DNA浓度后时PCR扩增。
Tab 1 The sources ,collectint time and condittion of the crude drugs studieds
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No |
Name |
Source |
Collectign time |
Conditions |
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1 |
Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag |
Shanxi |
1978.5 |
dried |
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2 |
Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag |
Shengang, Liaoning |
1982.6 |
dried |
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3 |
Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag |
Quanhang,Jilin |
1988.4 |
dried |
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4 |
Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag |
Changchum, Jilin |
1991.10 |
dried |
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5 |
Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag |
Northeast of China |
1994.11 |
dried |
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6 |
Asarum spp |
Institute of Acupuncture ,CATCM |
1997.7 |
dried |
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7 |
A. heterotropodes var, mandshuricum kitag. |
Northeast of China |
1997.7 |
fresh |
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8 |
A. sieboldii f. seouleuse C. Y.Cheng et C. S. Yang |
Northeast of China |
1994.11 |
dried |
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9 |
A. sieboldii f. seouleuse C. Y .Cheng et C. S. Yang |
Banxi, Liaoning |
1997.7 |
fresh |
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10 |
A. sieboldii Miq |
Shennongjia ,Hubei |
1996.7 |
dried |
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11 |
A. sieboldii Miq |
Luonan, Shanxi |
1997.7 |
fresh |
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12 |
A. caulescens Maxim |
Chengkou, sichuan |
1996.5 |
dried |
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13 |
A. caudigerum Hance |
Emei, Sichuan |
1997.7 |
fresh |
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14 |
A. splendens (maekawa) C. Y .Cheng et C. S Yang |
Emei, Sichuan |
1997.7 |
fresh |
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15 |
A. forbesii Maxim. |
Jiangpu ,Jiangsu |
1988.6 |
dried |
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16 |
A. forbesii Maxim. |
Jiangsu |
1997.7 |
fresh |
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17 |
A. caudigerellum C. Y . Cheng et C. S. Yang |
Emei, Sichuan |
1992 |
dried |
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18 |
A. caudigerellum C. Y . Cheng et C. S. Yang |
Emei, Sichuan |
1997.7 |
fresh |
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19 |
A. dabieshanense D. Q. Wang et. S. H. Huang |
Huoshan, Anhui |
1996 |
dried |
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20 |
A. dabieshanense D. Q. Wang et. S. H. Huang |
Huoshan, Anhui |
1997.7 |
Fresh |
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21 |
Artemisia argyi levl. et. Vant. |
Shenyang, Liaonign |
1991.2 |
Dried |
PCR反应 反应体系总体积50ul，其中引物为1 mmol·L-1，核DNA约150 ng ，Taq酶3U， dNTPS 各0.05 mmol·L-1。扩增程序为预变性5min，94度40s，38度45s，72度45s40个循环，后延伸72度5 min。取10 ul扩增产物于1.0%琼指糖凝胶上用1X TAE 电泳缓冲液电泳，紫外检测拍照。
