2. 2 TAIL-PCR的引物设计
根据载体的已知序列设计3 个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物,特异性引物的长度约20 bp , Tm 一般为58～68 ℃。再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物,简并引物相对较短,长度为14 bp , Tm 为30～48 ℃。为了增加简并引物与目标序列间退火的可能性,除了3′端的3 个碱基以外,其它位置的碱基包含简并核苷酸。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如果不能获得满意的扩增结果,则应该在预备实验中重新设计特异性引物或者换用其它的简并引物。在TAIL-PCR 反应中,高特异性循环的退火温度设为65 ℃左右,较低特异性循环的退火温度设为44 ℃,低特异性循环的退火温度设为25～30 ℃。反应体系中,特异性引物的浓度与普通的PCR 相同,简并引物的浓度要高,一般为2. 5～5. 0μmol/ L ,以满足引物的结合效率。
3 TAIL-PCR 产物分析
在多数情况下,第1 次反应有较多的非特异性产物。由sp1 和AD 为引物扩增出的特异性片段在第1 次反应中由于量少而不一定能显现出来。当用sp2 替代sp1 进行第2 次反应后,一些非特异性条带消失,特异性的产物被选择性地扩增而显现。欲增加产物的特异性,可以再把第3 次反应设置为TAIL 循环。由于特异性引物在第1 次反应中一般不能扩增到可被检测的水平,因此可以省去第1 次反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析,仅仅检测第2 次和第3 次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2 次反应产物和第3 次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的,因此特异性扩增的特点是第3 次反应产物小于第2 次反应产物。不同的AD 引物的扩增效率不同。有效的TAIL-PCR 扩增出的目标片段的大小应该在250 bp～2 kb。由于AD 引物在特异性引物的下游有多个退火位点,同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段[1 ] 。
4 TAIL-PCR 的优点以及技术难点
常规的PCR 只能扩增两引物之间的DNA 区段,难以对已知DNA 序列侧翼的未知序列进行扩增。Reverse PCR、Hemispecific、one2sided PCR 等方法可以部分地克服上述缺点,但在PCR 反应前必须作酶切、连接、加尾等一系列繁琐的操作。TAIL-PCR 技术能够快速地分离到目标序列,对基因克隆研究具有重要的意义。TAIL-PCR 技术有以下优点: (1) 简单。只要设计好引物,即可以用基因组DNA 作模板直接筛选到目标序列。节省了PCR 反应前后的许多费时、费力的操作程序。只需几纳克的DNA 即可作为模板,对其纯度的要求也不很高。(2) 特异性高。用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合,通过不对称的温度循环和分级反应,使反应体系有利于特异引物的扩增,最终的扩增产物中目的片段占绝对优势,反应产物可以直接用做探针标记和测序模板。(3) 高效灵敏。使用任何一个AD 引物,在60 %～80 %的反应中能够产生特异性产物。运用不同的AD 引物就能够有效地扩增到目标片段。(4)快速。整个TAIL-PCR 反应循环能够在1 d 内完成,可以快速地获得目标片段。(5) 不涉及连接反应,反应产物准确可靠,重复性好。
TAIL-PCR 反应需要较多的引物组合。此外,由于AD 引物存在有限的结合位点,对于个别的侧翼序列,即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。整个TAIL-PCR 需要一系列连续的反应,反应条件的设置要求比较精细。
TAIL-PCR 技术能够分离获得克隆载体上的DNA 序列,也能够用于基因组小的物种如拟南芥[3 ,8 ] 、水稻[9 ,10 ]和基因组大的物种,如小麦[1 ]以及哺乳动物[11 ]的已知序列两侧翼的DNA 序列的分离。上述优点使TAIL-PCR 技术成为分子生物学研究中的一种强大工具。
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