TAIL-PCR 一般分为3 次反应(图1) 。第1 次PCR 反应由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的序列(载体或T2DNA 等) 退火并延伸,提高目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,10 次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火,随后进行12 次TAIL 循环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物:特异性产物( Ⅰ型) 和非特异性产物( Ⅱ型和Ⅲ型) 。第2 次反应则将第一级反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过10 次热不对称的超级循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。第3 次反应又将第2 次反应的产物稀释1 000 倍作为模板,一般设置为普通的PCR 反应或热不对称的超级循环。通过上述3 次PCR 反应可获得与已知序列邻近的目标序列。
2 TAIL-PCR 的反应条件和引物设计
2. 1 TAIL-PCR的反应条件
TAIL-PCR 反应的条件在不同的实验中稍有变化。在表1 所示的条件下对P1 和YAC 克隆插入末端序列的分析中获得了满意的结果[1 ] 。这种反应条件亦是一个规范的实验设置,可以满足大多数实验的需要。
笔者用TAIL-PCR 方法研究T2DNA 标记的水稻( Oryz a sativa L. cv. Nipponbare) 突变体,用表2 所示的反应条件有效地分离到了T2DNA 侧翼序列(图2) 。图2 中第3 次反应产物( Ⅲ) 中的明亮条带即为扩增到的目标序列。
