罗丽娟1 ,2 ,施季森1 3
(1. 南京林业大学,江苏 南京 210037 ;2. 华南热带农业大学,海南 儋州 571737)
摘 要:在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错PCR(简称TAIL-PCR) 反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3 个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR 循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL-PCR 技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔者综述了TAIL-PCR 反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。
关键词:热不对称交错PCR ;特异性引物;简并引物;侧翼序列分离
TAIL-PCR:A Simple and Eff icient Method to Isolate DNA Segments Adjacent to Known Sequence
LUO Li-juan1 ,2 ,SHI J i-sen1 3
(1. Key Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering ,Nanjing Forestry University ,Nanjing 210037 ,China ;
2. South China University of Tropical Agriculture ,Danzhou 571737 ,China)
Abstract :Isolation of DNA f ragment adjacent to a known sequence is a tedious task in genome-related research. Thermal asymmet ric interlaced PCR ( TAIL-PCR) is an efficient technique for isolation of target DNA segment s flanking known sequences. It was utilized three nested sequence-specific primers with a shorter arbit rary degenerated(AD) primer respectively. Specific product s can be amplified through continuous cycles of amplification at different annealing temperature. The amplified product s are suitable for either hybridization probes or sequencing templates. TAIL-PCR technique is very simple and highly efficient . The specific product s can be obtained again in the same PCR mixture and the same PCR condition. All the TAIL-PCR reaction need only a few time as in one day. It has become a powerful tool in a genomic analysis.This article present s the principle and protocol of TAIL-PCR. Methods for primers design and product s selection are also discussed.
Key words :TAIL-PCR ;Special prime ;Arbit rary degenerate prime ;Flanking sequence isolation
热不对称交错PCR( Thermal Asymmet ric Interlaced PCR ,简称TAIL-PCR) 是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA 序列的分子生物学技术。该技术由Liu 和Whitter 首先研究并报道[1 ] 。在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。目前已成功地从P1 、YAC 和BAC 克隆中分离获得插入末端的DNA 序列和拟南芥( A rabidopsis thaliana L. ) 的T-DNA 侧翼序列[1～3 ] 。此外,经过改良的TAIL-PCR 技术能够快速克隆Pal 及Pgi 基因的启动子序列和野油菜黄单胞菌群体感应信号基因[4 ,5 ] 。该技术的问世,使分子生物学研究工作者能够简易而有效地从已知序列中分离到其邻近的未知侧翼序列,解决有关基因操作的一系列难题。现对此技术的原理、技术要点和难点作一综述。
1 TAIL-PCR 技术的原理
由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR 反应叫做“半特异性PCR”[6 ,7 ] 。这种反应会产生3 种不同类型的产物: (1) 由特异性引物和简并引物扩增出的产物; (2) 由同一特异性引物扩增出的产物; (3) 由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR 反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3 个嵌套的特异性引物( special prime ,简称sp1 ,sp2 ,sp3 ,约20 bp) ,用它们分别和1个具有低Tm 值的短的(14 bp) 随机简并引物(Arbit rary degenerate prime 简称AD) 相组合,以基因组DNA 作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物。反应流程如图1 所示。
图1 TAIL-PCR 反应流程图
Fig. 1 The protocol of thermal asymmetric interlaced PCR
