分子细胞学技术基本理论知识--生物秀

2．序列（Sequence）：
DNA中核苷酸的排列称序列或顺序。凡有意义的排列关系叫作密码（ Code）或信息，但并非所有序列都有意义的。能表达和最终能合成蛋白质的排列顺序是有意义的，基因就属于这种序列。在DNA中反复出现的序列叫作重复序列（ Repeated Sequenc e）；根据它们重复次数的多少，可分为：高度重复序列、中度重复序列和单拷贝（Copy）序列三种。高度重复序列的长度，由2~10 个核苷酸组成，如人的Alu 序列，重复次数达上百万次之多；中度重复序列，可从几个核苷酸到几千个之多组成，重复次数在几十次到几千次之间。单一拷贝的序列，在基因组中只出现一次或几次。真核细胞中单拷贝序列和重复序列是间隔排列的，在基因之间的重复序列叫间隔。重复序列有编码（表达）和不编码之分，间隔为不表达序列，基因内含子也属不编码重复序列。基因也有重复现象，重复次数多少与编码蛋白质的数量有关，需量大者重复多，如编码rRNA、tRNA 等的基因属重复序列。
3．基因：（图13-2，3）
人类一个基因平均由1~3kb（千碱基对）个核苷酸对（Base Pair：bp）组成，在一个基因中也有不表达的顺序，如rRNA、tRNA基因、珠蛋白基因等，或称蛋白质基因。另类基因不编码任何东西，但有重要调节作用，其中包括调节基因（Regulater）、启动子（Pro-moter）、增强子（Enhencer）、沉寂子（Silencer）等，它们与结构基因构成协同基因群，共同完成表达过程。人类编码蛋白质基因包括四个区域：人类基因并非都发生编码活动，从形成最终产物（蛋白质或酶），与否，基因可分成两类，一类为编码基因，如rRNA、tRNA 基因、珠蛋白基因等，或称蛋白质基因。
另类基因不编码任何东西，但有重要调节作用，其中包括调节基因（Regulater）、启动子（Pro-moter）、增强子（Enhencer）、沉寂子（Silencer）等，它们与结构基因构成协同基因群，共同完成表达过程。人类编码蛋白质基因包括四个区域：
【结构基因或表达区】有内含子外显子；一个基因外显子的数目不同，一般有2~30个；内含子介于外显子之间，数目与外显子相近。
【调控区】包括启动子和增强子等，位于编码区的5′或3′端。
【前导区】位于编码区的上游，即编码区的5′端区。
【尾端区】位于编码区的3′端区。
4．基因结构多态性：
从理论上讲，有相同功能的基因其构成应是相同的，事实上并非如此，两个相同功能的基因，产物相同，结构并不一定完全一样。表现在用同一内切酶切割时，两个相同基因的酶切位点不同，说明核苷酸序列不一致，即结构上有差异。这种现象称多态性（Poly-morhism）。
5．基因与染色体：
人类的全部遗传信息或基因都包含在46 条染色体上，由3×109bp 组成，共编码50 000~100 000 个基因；人的染色体平均为130Mb（106bp）平均含有2000~4000 个基因。
（二）DNA 生物性状：
1．变性和复性：
DNA双链借氢键相连，凡能破坏氢键的因素，如加热、强酸、强碱等，均可导致DNA双螺旋破坏，此现象称变性（Denaturation）。变性既受外界因素影响，也与本身结构有关；DNA 中G-C 间有三个氢键，A-T 只有两个，在相同变性条件下，A-T 破坏在先，G-C在后。因此含G-C 比A-T 多的DNA 在结构上比较稳定。双螺旋DNA 分子具有一定的韧性，在溶液中粘度较大，变性后DNA分离成单链，成为无规则的线团，溶液性质也
发生了变化：粘度降低、沉降速度增加、紫外线吸收值升高、生物活性丧失。另外，DNA发光基团（碱基）原在双螺旋内，变性后碱基暴露出来，因此变性也伴随着光学性质的变化。这些都可用于追踪DNA 变性过程。利用DNA 变性后的增色效应，是跟踪DNA变性过程的最方便的手段；比如用升温法使DNA变性，以温度对紫外吸收值作图，能得到一条S 曲线（图13-2）。产生紫外线吸收值跃变的温度称DNA 的熔点，通常是以使增色效应达到一半的温度作为熔点。熔点不仅受DNA本身性质影响，也与溶液条件有关。据DNA 变性中对紫外线吸收变化，可用分光光度计检测核酸的O.D.值（Opti-cal Density）作为进行核酸定量的依据（可附录）。解除变性条件后，变性的两条互补链可重新结合起来，再恢复成原来的双螺旋，这一现象称复性（Anneal）。DNA 复性速度受很多因素影响，归结起来有以下几点：
【温度】同一种DNA，温度条件较高的复性快；温度降低DNA 运动速度缓慢，减少碰撞机会，复性慢，并使误配对的片段很难再解开寻找到正确互补链。
【DNA 片段大小】长链DNA 的扩散速度，比片段小的DNA扩散慢。
【离子浓度】复性速度与离子浓度成正比。
掌握DNA 变性与复性规律，对分子细胞学技术如分子杂交等，有很大实用意义。
2．DNA 复制：
DNA 的复制，邓DNA 自身的合成。DNA以半保留方式复制；复制后DNA 的双链一半来自旧的，另半为新合成的。DNA复制过程十分复杂，涉及30 多种酶和蛋白质的协同作用。原核生物细菌和病毒DNA 复制始于特定位置，真核生物DNA 复制有多个起始点；E.Coli 复制代需20 分钟；而人染色体DNA 比E.Coli DNA 大40 倍，仅3 分钟即可完成。复制开始，由DNA 解链酶使合成部位双链解开，形成复制叉（图13-3）。人DNA
复制是不连续的，有多个起点同时进行。DNA 复制过程中需要有引物（Primer），引物是一种RNA；引物的合成称引发，引发过程非常复杂。引物先附于合成起始点，而后DNA 聚合酶从RNA 引物3′端开始合成DNA新链。即以两链为模板在DNA聚合酶（III）的作用下，各自分别以5′→3′的方向，按A-T，G-C 互补关系把各种核苷酸联结起来，每次增加一个核苷酸；原核生物每分钟合成约为10⁵bp，真核生物为5×10²~5×10³bp。
（三）基因的生理活动：
1．基因表达：
基因产生功能的过程称表达（Expression），也叫编码（Code）。即遗传信息从DNA传给RNA，再通过翻译产生蛋白质的过程。信息从DNA 传给RNA 的过程叫转录（Tran-scription）；RNA 产生蛋白质的过程称翻译（ Translation）。表达由转录开始；DNA双链在转录时分开，能转录RNA 的那条DNA 单链叫有意义的链（Sense Strand）；它起模板作用，因此也叫正链（Positiive Strand）；对应的另条链叫反意义的链（Antisense
Strand），是为负链（Negative Strand）；但正链和负链并非总是在一条DNA 单链上；在一条单链DNA 上既可有正链也可有负链。基因在编码过程中，外显子和内含子一起转录，形成前体mRNA（hnRNA），在进入细胞质前内含子表达的部分被加工剪切（Splicing）掉，只有外显子编码的RNA部分保留并相连接起来形成最终的mRNA，再进入细胞质中（图13-3）。基因表达通过mRNA翻译，最终产物为酶或蛋白质。所谓基因遗传型（Genotype）是指基因或染色体组成特点，而基因表型（Phenotype），是指基因产物（蛋白质或酶）状态或生物大体表现（如性别，肤色等）