加强免疫
间隔2-4周,可进行多次
0.5ml抗原(蛋白量减半)
0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)
制备抗原-佐剂乳化液
背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价
酶联法：1:104以上，能达到1:106。
免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64
效价达到要求的可放血制备血清
可一次放血(颈动脉)
也可多次取血(耳静脉)
单抗与多抗的区别
什么情况需要制备单抗
目的蛋白有结构类似物
抗原不纯，无法分开
多抗效果不好（已排除非特异性反应）
希望将抗体用于治疗，研制成药品
希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
三、抗体的纯化
盐析法（硫酸铵沉淀)
辛酸-硫酸铵沉淀法
离子交换法
亲和层析法
凝胶过滤法
1、盐析法（硫酸铵沉淀)
原理
在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀硫酸铵是最常用的中性盐不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示(100%饱和度:767g/L)
主要步骤
在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀；4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀；
可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度:
50%饱和度: 0.313g/ml
45%饱和度: 0.277g/ml
40%饱和度: 0.243g/ml
最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析，测定浓度。
特点
成本低，步骤简单。
抗体的回收率比较高。
抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标记。
需要高速离心机。
2、正辛酸-硫酸铵沉淀法
原理
两步沉淀：先加正辛酸去杂蛋白.正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀.后加硫酸铵使抗体沉淀.
主要步骤：
调节样品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),搅拌30分；。
室温高速离心(10000g，30分钟),收集上清液；
再加入硫酸铵（40%饱和度）；
4℃高速离心(10000g，15分钟) ,弃上清；
溶解沉淀，透析，测定浓度。
