4. IEF后胶条的平衡
SDS平衡缓冲液为：50mM Tris-Cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, trace bromophenol
还原：100mg DTT/10 ml SDS 平衡buffer，15min;
烷基化：250mg iodoacetamide/10ml SDS平衡buffer, 15min.
5. 胶条向第二向转移
将IEF后的胶条转移到垂直板聚丙烯酰胺上，用1%的琼脂糖封闭，从而使胶条上的蛋白转移到第二向分离胶中，根据分子量大小将pI接近的蛋白进行进一步分离。
6. SDS-PAGE
注意：进行第二向SDS-PAGE时，要求恒温，但温度不要低于15℃，否则会引起凝胶收缩，影响蛋白从胶条向第二向凝胶的转移。
7. 2D胶的染色
考马斯亮蓝染色，常用考马斯亮蓝R250,R350(sensitivity: 1ug/spot)
负染(negative staining), 如锌染 (ST: 50 ng)
银染，为了有利于对2D胶上的蛋白进行质谱鉴定，最好不要使用戊二醛，因为戊二醛会和蛋白质交联，降低肽提取效率(0.1 ng)。
荧光染色，为了提高灵敏度，常采用荧光染料染色,e.g., SYPRO Ruby, ST:1-2 ng, single step, available for automation
放射性同位素染色(125I,32P, 14C or 35S),标记的蛋白质直接进行放射自显影
Comparison of fluorescent labelled 2-D gel with silver staining
8. 图像分析
在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。
图像分析一般程序
Image visualization and manipulation
Spot detection and quantification
Spot matching
Editing matches
Molecular weight and pI calibration
Synthetic and average gels
Analyzing the data
Annotating the gels
Image analysis with ImageMaster Platinum
Image analysis with ImageMaster Platinum
Spots report
