脂的去除
Lipids may interact with membrane proteins and consume detergents.
High speed centrifugation of lipid-rich material
Extraction of the biological material with organic solvent (e.g.,ethanol or acetone)
However, loss of proteins because certain proteins are soluble in the organic solvent or because the precipitated proteins do not always resolubilize
核酸的去除
Nucleic acids can interact with carrier ampholytes and proteins and give rise to 2D patterns containing horizontal streaks and increase the viscosity of the solution and may clog the pores of the gels.
TCA/aceton (typically, 20%TCA in pure acetone) precipitation;
Protease-free RNase and DNase
Ultracentrifugation and addition of a basic polyamine such as spermine;
sonication
制备样品的原则
样品制备步骤越简单越好，避免目的蛋白的损失或丢失。
裂解细胞或组织要防止蛋白降解。裂解细胞应在低温下进行(冰水浴或4℃)，最好用加有蛋白酶抑制剂的裂解液直接裂解。
样品裂解液应新鲜配制，或分装冻存，而且要采用高纯度的去离子尿素
蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或-80℃分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。
通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。
为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后，不要加热蛋白样品。当样品中含有尿素时，加热绝对不要超过37℃.升高温度会使尿素水解成异氰酸盐(isocyanate),使蛋白发生氨甲酰化(carbamylation)修饰。
最好用强烈变性剂直接裂解样品，这样可以使蛋白水解酶立即变性失活。
细胞裂解方法
比较温和的裂解方法包括：
渗透裂解(Osmotic lysis)，此法特别适合分离亚细胞组分，如血细胞、组织培养细胞的裂解；
冻融裂解法(Freeze-thraw lysis)，快速将细胞冻于液氮中，然后融解，重复进行，如细菌、组织培养细胞的裂解；
去污剂裂解法(detergent lysis)，去污剂融解细胞膜，从而裂解细胞，释放其中成分，如组织培养细胞的裂解；
酶裂解(enzymatic lysis)，具有细胞壁的细胞通过酶除去细胞壁。细胞用溶菌酶(lysozyme)，植物细胞用纤维素酶(cellulase), 果胶酶(pectinase),酵母用溶细胞酶(lyticase)。
强烈的裂解方法包括：
超声波破碎，但要注意减少热能和泡沫的产生，以防止蛋白质变性或被剪切。
手工研磨，常可以加入石英砂。或采用研钵(mortar)，或匀浆器(pestle)在液氮中研磨，如固体组织或微有机体的研磨。
蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟(PMSF, 1mM)，PMSF为酶的不可逆抑制剂，用于serine proteases及cysteine proteases的抑制。
1mM EDTA或1mMEGTA
Peptide protease inhibitors
AEBSF (4mM)
苯脒(Benzamidine) (1-3mM)
其中，PMSF,EDTA及肽蛋白酶抑制剂, e.g., leupeptin(亮抑酶肽), pepstatin(胃蛋白酶抑制剂), aprotinin(抑制丝氨酸蛋白酶的碱性多肽), bestatin(亮氨酸类似物）是最常用的几种蛋白酶抑制剂。
常用的蛋白质沉淀方法
硫酸铵
三氯乙酸(TCA)
丙酮，放于-20℃时效果会更好
TCA＋丙酮
2. IPG 胶条重泡胀(rehydration)和上样(loading)
因为采用预制的IPG干胶条，需要用重泡胀液(rehydration solution)使其重性水化膨胀成凝胶，使样品能够充分进入凝胶内，完成上样。 可用重泡胀液在室温浸泡12h后上样，或在低电压(30v)下室温12h,使IPG干胶条边水化膨胀边上样。
Rehydration solution
8 M urea, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 0.5-2% IPG buffer/pharmalyte
3. 第一向 等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)
IPG Phor等电聚焦仪
典型的IEF条件举例
采用安玛西亚公司IPG Phor等电聚焦仪，pH 3-10的非线性胶条，蛋白上样量250μg，体积350μl。电流为50μA／strip，所用电泳条件为30V,12h;100v,1h; 500v, 1h;1000v,1h; 8000v,1h(gradient); 8000v,10h，共用时26h，IEF结束后vhs为80000左右。
