（二）紫外光谱吸收法
1．原理  本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂，测完后，样品可回收。
    2．标准曲线的制备
    ⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理盐水中。
    ⑵ 以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以盐水对照。
    ⑶ 测各管OD280值。
    ⑷ 以OD280值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
    3．样品测定
将待测样品以盐水适当稀释，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间，以生理盐水为对照，测OD280值，从标准曲线上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
    1．原理  蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后，在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钼蓝）。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中脂多糖的干扰。
    2．试剂
    试剂甲：
A液：Na₂CO₃                 10.00g
      NaOH                   2.00g
      酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g
     混合、溶于500ml蒸馏水中。
B液：CuSO₄·5H₂O               0.5g
       H₂O                 100.00ml
        用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。
试剂乙：
   于磨口回流瓶加入下列试剂
   Na₂WO₄·2H₂O                100.00g
   NaMoO₄·2H₂O                 25.00g
   H₂O                          700.00ml
   85％H₃PO₄                      50.00ml
   浓HCl                         100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：
   硫酸锂                       150.00g
   H₂O                          50.00ml
   溴水                          数滴
开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色微带绿色（如仍呈绿色，须重复滴加液体溴步骤）。稀释至1L，过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准NaOH液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约1倍）使最终浓度为1mol/L。
3．标准曲线的制备
⑴ 取标准牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸馏水中，使成250μg/ml。
⑵ 按表8-2稀释。
表8-2 标准曲线稀释方法

成分	试          管            号
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
牛血清白蛋白标准品（ml）	0	0.2	0.2	0.4	0.1	0.6	0.6	0.8	0.8	1.0	1.0
生理盐水（ml）	1.0	0.8	0.8	0.6	0.6	0.4	0.4	0.2	0.2	0	0
蛋白含量(μg／ml)	0	50	50	100	100	150	150	200	200	250	250

⑶ 每管加试剂甲5ml，混合后室温放置10min，再加0.50ml试剂乙（即Folin酚试剂），立即摇匀（否则显色降低）。
⑷ 30min后测OD650nm。
⑸ 以OD为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
    4．样品测定
    ⑴ 待测样品1ml（适当稀释至约含25μg－250μg/ml）。
    ⑵ 加试剂甲、乙。
    ⑶ 比色、测OD650值。
⑷ 查标准曲线，求蛋白含量乘以稀释倍数，即为样品的蛋白含量。
（四）紫外分光测定法
A1%1cm＝13.8（IgG）(280nm)
A1%1cm＝14.5(IgM)(280nm)
蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260  （此为经验公式，即以不同浓度的蛋白质和核酸混合测定的数值所建立的）。
 
十、蛋白质的浓缩技术
 
蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。
（一）透析袋浓缩法
利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。
（二）冷冻干燥浓缩法
这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。
（三）吹干浓缩法
将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。
（四）超滤膜浓缩法
此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。
（五）凝胶浓缩法
选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。
（六）浓缩胶浓缩法
浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。
 

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