（二）操作方法
1．取一定量的血清，加等量的生理盐水，然后逐渐滴加饱和硫酸铵溶液，使成40％的饱和度,静置30min。
2．10 000r/min离心10min，去上清。
3．加入一定量的生理盐水，使沉淀溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使成40％饱和度。10 000r/min离心10min，去上清。
4．再重复步骤3一次。
5．将沉淀以少量生理盐水溶解，透析，除盐浓缩。
6．制备DEAE-纤维素柱，以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。
同时制备SephadexG200凝胶柱，以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并进行洗脱。
7．以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脱，得蛋白液为IgG。
8． 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脱，得蛋白主要是IgE，再过SephadexG200凝胶柱，收集第一峰即为纯IgE。
9．以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脱，得蛋白主要是IgA，再过SephadexG200凝胶柱，收集第一峰即为纯IgA。
10．以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脱，洗脱液主要有IgM、IgG及白蛋白的混杂物。
11．以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脱，得蛋白液主要是IgM。过SephadexG200，收
集第二峰即为纯IgM。
八、Fab片段的制备方法
利用胃蛋白酶分解IgG，将抗体断链为Fab和Fc片段。具体操作方法如下：
1．将IgG粉末100mg，溶于2ml0.10Mol/L pH4.0醋酸缓冲液。溶液稍成白浊，30℃，保温10min。
2．取结晶胃蛋白酶1.50mg，溶于1.50ml 0.10Mol/L pH4.0醋酸缓冲液，加入上述溶液中，于30℃作用16h。
3．用0.10Mol/L pH8.0 PBS透析一夜。
4．加入硫醇使成0.10mol/L，在室温下搅拌30min。
5．加入1Mol/L的碘乙酰胺（Indoacetamide）使成为0.10Mol/L，室温下搅拌1h。
6．用0.01Mol/L PBS 1 000ml透析过夜，3 000r/min，离心30min，去沉淀。
7．以上清过SephadexG100(40cm×2.0cm)以0.10Mol/L PBS洗脱。
8．以每管6ml收集，约在第8管开始，Fab片段被洗脱。
9．测OD280nm，将Fab管合并，浓缩、冻干。
10．如制备F(ab)2，上述4～6步骤则可以省略。
九、蛋白定量技术
（一）双缩脲测定法
1．原理 蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出毫克水平。
2．试剂配制
硫酸铜（CuSO4·5H2O） 1.50g
酒石酸钾钠 5.00g
H2O 500.0ml
10％氢氧化钠（不含硫酸钠） 300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。
3．标准曲线的制备
⑴ 准确称取牛血清白蛋白1.0g（必要时须首先采用凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量，然后换算），以生理盐水配成1％的浓度。
⑵ 将1％的牛血清白蛋白按表8-1进行稀释：
表8-1 牛血清白蛋白稀释方法表
|
成 分 |
试 管 号 | ||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 | |
|
1％蛋白液（ml） |
1.0 |
.09 |
0.8 |
0.7 |
0.6 |
0.5 |
0.4 |
0.3 |
0.2 |
0.1 |
－ |
|
蛋白含量（mg） |
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
－ |
|
生理盐水（ml） |
0.5 |
0.6 |
0.7 |
0.8 |
0.9 |
1.0 |
1.1 |
1.2 |
1.3 |
1.4 |
1.5 |
|
双缩脲试剂（ml） |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
|
试剂蛋白含量（mg） |
8.0 |
7.2 |
6.4 |
5.6 |
4.8 |
4.0 |
3.2 |
2.4 |
1.6 |
0.8 |
0 |
注：1％牛血清白蛋白，经凯氏定氮测定含纯蛋白为80％。
⑶ 混匀后于室温放置0.5h～1h，光电比色（540nm），顺序由低浓度至高浓度，每管测3次，求其平均值。
⑷ 以OD值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。
4．样品测定
⑴ 取样品0.1ml，加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml，再加生理盐水0.5ml。
⑵ 加双缩脲试剂4.0ml，混匀，至室温0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。
⑷ 测OD540值。
⑸ 根据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。
注意：各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。
