二、 IgA的分离与提纯
 
（一）材料与试剂配制
1．DEAE52纤维素
2．0.10Mol/L ZnSO₄液
ZnSO₄·7H₂O          2.88g
加水至1 000.00ml
3．饱和硫酸铵溶液
4．10％EDTA—Na
5．SephadexG200
6．0.01Mol/L pH7.4PB液
7．0.10Mol/L pH6.4PB液
8．血清
（二）操作方法
1．取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO₄液，调pH至7.0，室温搅拌1h，离心去沉淀。
2．于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置30min或冰箱过夜。
3．10 000r/min离心10min，去上清。
4．取沉淀溶于4ml10％EDTA－Na溶液中。
5．生理盐水中透析除盐。
6．过DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白（IgG）弃去。
7．换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。
8．再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脱液测OD280值，取第一峰即为纯化IgA。
9．透析、浓缩、鉴定。
 
四、分泌型IgA的分离与鉴定
 
（一）材料与试剂
1．初乳
2．SephadexG200
3．0.10Mol/L pH6.8PB液
4．0.01Mol/L pH7.4PB液
5．DEAE52
（二）操作方法
1．取初乳20ml，10 000rpm离心10min，弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。
2．取乳清过SephadexG200柱（柱规格为2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱，第一峰为IgA（含IgG）。
3．  收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
4．  将透析液浓缩至5mg/ml以上。
5．  过DE52层析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱，洗下蛋白峰为IgG，弃去。
6．  换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脱，
收集洗脱液 ，即为较纯的IgA液。
7．  必要时，可再过一次SephadexG200柱。
8．  浓缩，鉴定 
  
五、禽IgA提取与纯化
 
（一）材料与试剂配制
1．禽胆汁
2．饱和硫酸铵溶液
3．0.01Mol/L pH7.4PBS液
4．0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）
5．  DEAE52-纤维素
（二）操作方法
1．取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25％饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
2．  3 000r/min离心30min，去沉淀。
3．  取上清，加饱和硫酸铵液，使成35％的饱和度，4℃放置30min。
4．  3 000r/min离心30min，弃上清。
5．  取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。
6．  将沉淀用0.85％NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7．  以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱（20×250mm）。
8．  取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
9．  再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl浓度为0.30Mol/L）洗脱，收集洗脱液。
10．浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页