【实验方法】
⒈ 准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱
通常准备5ml或10 ml蛋白A sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将蛋白A sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。
⒉ 制备抗血清
将抗血清放入冰水或4°C冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37°C预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4°C，15,000xg离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。
⒊ 亲和层析
将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。
在柱中加入10ml,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2°C~8°C保存。
用含0.05%叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2°C~8°C环境。
【实验结果】
利用SDS/PAGE检查洗脱获得的蛋白纯度并利用免疫电泳技术检查纯化后抗体的滴度。
【注意事项】
⒈ 叠氮化钠有毒，应戴手套并小心操作
⒉ 在纯化过程中，预冷的TBS缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微生物的代谢。
三、免疫电泳
【实验原理】
免疫电泳又称为γ球蛋白电泳或免疫球蛋白电泳技术，这是一种能够判断血液中三种免疫球蛋白IgM, IgG, IgA含量水平的实验方法。在这项实验技术中，首先利用蛋白质的分子量和所带电荷的比值运用水平琼脂糖凝胶电泳技术将蛋白质进行分离，然后将特异性的抗体引入到与电泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗体的扩散过程中，抗原和抗体适当比例的结合会导致沉淀的产生（如图）。0.85%盐不仅可以终止扩散过程也可用于洗去未结合的蛋白，抗原和抗体结合所形成的沉淀线即可以肉眼观察也可利用染色方法观察。
免疫电泳技术不仅可用于血清或尿样中单克隆抗体的鉴定，也可用于其它方面，比如免疫复合物的筛选、各种异常丙种球蛋白血症的识别和鉴定等。免疫电泳技术也是进行蛋白质常规评价的一种可靠，精确的实验方法，可观察蛋白质结构的变化和浓度的改变。
【实验材料】
⒈ 实验器材
水平电泳仪；打孔器；滴管；刀片；电源；水浴(55°C)；蒸馏水；烧杯(400-600ml)；
加样枪(5-100ul)。
⒉ 实验试剂
⑴ 纯化的抗体；蛋白质混合物；1%琼脂。
⑵ Tris-巴比妥缓冲溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸钙及0.065g 叠氮化钠溶于100ml 蒸馏水中。
⑶ 电泳缓冲溶液：将Tris-巴比妥缓冲溶液与蒸馏水按1：4的比例混合。
【实验方法】
⒈ 准备琼脂糖凝胶
将琼脂和电泳缓冲溶液混合放入90°C水浴加热至溶化，制成1%琼脂，将琼脂在冷却前铺在水平玻璃板上，待冷却至室温后，按图用内径4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。
⒉ 电泳
将用电泳缓冲溶液稀释的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，将胶板放入电泳槽中并用润湿的滤纸将胶板和电泳槽中的缓冲溶液相连。盖上电泳槽盖，接通电源，6V/cm通电至前沿移动约35mm，时间约为1小时，利用示踪染料判断移动距离。
⒊ 扩散
将胶板移出电泳槽并放在水平位置上,用滤纸润干胶板凹槽中的缓冲溶液,在凹槽中加入适量的抗体(0.2ml~0.25ml)，注意抗体不能溢出凹槽以避免污染.将胶板移至含有叠氮化钠且有一定湿度的盒内,加盖密封后在30°C水浴扩散至少10小时后，移至0.85%盐水中以终止扩散并洗去未结合的蛋白。
【实验结果】
观察抗原和抗体之间所形成的沉淀线，并进行记录。
【思考题】
⒈ 什么是抗原和抗体？并解释抗原抗体结合的特点。
⒉ 简述免疫电泳的基本原理。
