【实验目的】
1．了解PCR-DHPLC技术的原理。
2．了解并熟悉PCR-DHPLC技术的步骤。

【实验原理】
DHPLC技术也称为WAVE核苷酸片段分析系统。利用高效液相色谱原理，PCR扩增后的DNA片段与缓冲液（TEAA）混合形成液相，流动相被高压驱动，通过一个DNA分离柱——DNA Sep柱，该柱可对DNA片段进行分离和分析。变性温度是影响DNA片段分析的一个重要因素，变性温度升高，保留时间缩短。洗脱的核苷酸片段经检测器检测后转换为数字信号记录并储存于计算机中。
在部分变性条件下，DNA Sep柱可检测突变。杂合的个体在部分变性条件下（95℃变性后逐渐冷却到一定温度）形成纯合和杂合双链。两者通过DNA Sep柱时保留时间不同而得以区分。
DHPLC方法不需要灌胶、上样、电泳等繁琐的操作，快速、自动，可检测片段长达1500bp，准确率达96%以上。

【实验用品】
1．PCR扩增仪；WAVE DNA片段分析系统；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。
2．TEAA、乙腈、琼脂糖
3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。Tip头盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
4．PCR扩增相关试剂。

【实验步骤】
1．PCR反应（同前）
2．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。
3．缓慢变性
95℃变性5分钟，然后以0.03℃/S速率缓慢复性至25℃，使杂合子形成异源双链。
4．确定熔解温度
根据温度预测软件对DNA片段进行序列分析，确定熔解温度。
5．取10μl缓慢变性PCR产物上样，分析流出峰峰形。

【实验结果分析】
观察并记录流出峰峰形及位置，根据异常峰形筛查突变样本。

【思考题】
1． PCR-DHPLC检测突变的基本原理是什么？
2． 为什么PCR产物要经过缓慢变性过程？
3． 如何确定样品的熔解温度？