Polymerase Chain Reaction –Restriction Fragment Length Polymorphism

【实验目的】
1．熟悉PCR—RFLP分析技术原理及实验步骤。
2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。
3．了解PCR—RFLP在遗传病基因诊断中的作用。

【实验原理】
聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温(约93℃-95℃)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温(约50℃-70℃)下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70℃-75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n倍,一般PCR经30-40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。
聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR—RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR—RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。
本实验以家族性甲型血友病患者及其相关成员外周血DNA为模板，PCR扩增凝血因子FⅧ基因的583bp特异片段产物，其中包含MspⅠRFLP多态位点，经MspⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度（583bp或360bp+223bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断胎儿是否得到了带有缺陷FⅧ基因的染色体，从而做出间接基因诊断。

【实验用品】
1．DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）10×PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶MspⅠ（20U/μl）、10×酶切缓冲液。
2．2%的琼脂糖凝胶、5×TAE、6×上样缓冲液、DNA Marker、溴化乙啶贮存液（10mg/ml）（EB）。
3．PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器（20μl、200μl）、枪头（20μl、200μl）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、浮漂、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。

【实验步骤】
一．PCR反应
PCR反应体系20μl，其成分如下：

按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.5ml离心管中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。

PCR 反应循环温度：
94℃预变性3分钟，然后进行以下循环30次

最后经72℃再充分延伸7分钟。
反应结束后置4℃冰箱保存。

二．PCR产物的MspⅠ酶切
反应体系20μl其成分如下：

置37℃水浴消化1小时，4℃保存。

三． 琼脂糖凝胶电泳检测
1．胶板的准备
取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
2．2%的琼脂糖凝胶的制备
称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
3．将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10min。
4．每份限制酶切产物取10μl，加2μl  6×上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100V 电泳50分钟。
5．断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCR—RFLP结果。

【实验结果与分析】
根据甲型血友病患者及其相关成员的亲属关系绘制遗传系谱图，观察并记录琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段长度，绘制出家系各成员FⅧ基因MspⅠ RFLP等位片段与系谱相关图，进行连锁分析，判断胎儿是否是甲型血友病患儿。