AgNO₃ Staining NOR and Satellite Association of Acrocentric Chromosome

【实验目的】
熟悉银染的原理和方法。

【实验原理】
人类近端着丝粒染色体的副缢痕与核仁形成有关，故称为核仁形成区（NOR）。当位于此处的18S、28S核糖体RNA的基因（rDNA）具有转录活性时，应用银染技术可使NOR特异性着色（褐黑色）。进一步证明银染物质不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成区特异的蛋白质，即和rRNA转录相联系的酸性蛋白。人类核糖体RNA基因位于5对近端着丝点染色体短臂的次猛痕处，即人类的核仁形成区。在正常人中， 不是所有核仁形成区均被银染，其范围大约4-10。应用银染法可以觉察正常人体核糖体RNA基因的活动。此外，人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合，应用银染技术可在发生联合的染色体间清楚地看到银染物质相连。因此，应用银染核仁形成区（Ag-NOR）与近端着丝粒染色体随体联合（Ag-AA）技术，可以分析有活性的rRNA基因的动态变化。正常人Ag-NOR平均为5.8/细胞。

【实验用品】
1. 恒温水浴箱、显微镜、平皿、牙签、擦镜纸、镊子；
2. 预制染色体玻片标本、0.1％甲酸、AgNO₃（50％）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl。

【实验步骤】
1. 按半微量法采取外周静脉血，接种培养。常规法制片。将染色体玻片标本在室温下放置2～3天。
2. 将标本置入5mol/L HCl溶液中常温处理5分钟，蒸馏水冲洗2-3次，甩干。
3． 将500mg AgNO₃溶于1 ml 0.1％甲酸溶液中，混匀后立即滴4～5（5ml）滴至玻片标本上。
4. 在平皿中平行放置两根牙签，将玻片标本放在牙签上。
5. 在标本上盖一张比玻片稍小的擦镜纸，用镊子掀动纸片数次，使染液均匀分散在标本上。
6. 将平皿置于60℃水浴箱中处理3-5分钟，直至擦镜纸呈棕黄色终止反应。
7. 蒸馏水冲洗去擦镜纸，以1：20 Giemsa染液复染3分钟。水洗，气干。
8. 镜下观察。

【实验结果与分析】
1. Ag-NOR的计数：选择银染着色清晰的分裂相，计数6个D组（13、14、和15号染色体）和4个G组（21和22号染色体）近端着丝粒染色体，不论单侧或双侧的银染点都计数为一个有银染的染色体。
2. Ag-AA计数：凡近端着丝粒染色体之间有银染物质相连的，均计数为Ag-AA。涉及2条近端着丝粒染色体的联合，记为1个Ag-AA；涉及3条近端着丝粒染色体的联合，如未形成闭环的，记为2个Ag-AA；3条染色体联合形成闭环时，记为3个Ag-AA；依此类推。

（注：避免AgNO3 溶液污染皮肤，否则将其染成褐黑色，很难洗掉。）